徐晉，吳麗，徐巧芳

(江蘇省第二中醫院外科，江蘇南京 210017)

 

    肝必復軟膠囊的主要成分取自樹舌靈芝多糖，能有效促使乙肝表面抗原轉陰，為乙肝患者帶來康復福音。本文就藥理學角度，初步研究探討靈芝多糖誘導人肝癌細胞HepG2凋亡的作用。

    20世紀70年代以來，國內外一系列研究證明傳統中藥靈芝(Ganoderma lucidum)具有免疫調節、抗病毒、保肝、抗氧化等藥理作用，尤其是其抗腫瘤活性日益受到關注。靈芝多糖(GLPS)是靈芝水提物中的主要活性成分，對動物移植性腫瘤具有抑制作用，可使瘤重減輕，生存時間延長。但其作用機制目前還處于研究階段，因此本研究主要通過觀察靈芝多糖與常規化療藥物 (氟尿嘧啶) 聯合使用對人肝癌細胞HepG2的體外生長狀況，檢測 Caspase-3、Caspase-8酶活性有無顯著變化，并采用Western-blotting技術檢測作用后肝癌細胞HepG2的細胞色素C、Caspase-3、Caspase-8蛋白的表達水平，對其抗腫瘤機制做進一步的研究，為靈芝多糖的藥用價值提供新的實驗依據。

    1 資料與方法
    1.1 實驗資料
    段木栽培靈芝多糖 (Ganodenna lucidum Polysaccharides，GLPS)由福州綠谷生物藥業技術研究所提供。褐色粉末，易溶于水，平均分子量為584900。多糖與肽的比值為93.45％：6.49％，多糖部分由鼠李糖、木糖、果糖、半乳糖、甘露糖和葡萄糖組成；MTT[溴化 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑](美國sigma公司產品)、二甲基亞砜(DMSO，上海凌峰公司,分析純)、RPMI 1640培養液(DMEM)和胎牛血清(美國GIBCO公司)、氟尿嘧啶注射液(南通精華制藥有限公司，批號080212)、兔抗人細胞色素C、Caspase-3、Caspase-8、一抗IgG(美國Santa Cruze公司) 、B-actin單抗、辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗IgG(武漢博士德生物有限公司)，其余試劑均為分析純級。

    1.2 細胞處理
    肝癌HepG2細胞，購丁上海亞培生物科技有限公司，細胞用5％胎牛血清的RPMI 1640培養液，37℃，5％C02，傳代培養。每24～48小時傳代1次。控制細胞密度為 2×105／ml，加藥時稀釋培養液，加入無血清R PMI 1640配制成的各組含藥培養液200μL，37℃，5％CO共孵育48h后，監測各項指標。

    1.3 分組方法
    分為A、B、C、D、E 5組，其中，A組：對照組；B組：氟尿嘧啶50μg/ml；C組：氟尿嘧啶50μg/ml+GLPS 1μg/ml；D組：氟尿嘧啶50μg/ml+GLPS 10 μg/ml；E組：氟尿嘧啶50μg/ml+GLPS μg/ml。

    1.4 MTT法測細胞增殖抑制率
    MTT粉劑以超純水配制成5 mg/ml工作液，細胞作用48h后，每孔加入20μL MTT，37℃孵育4h，吸出孔內培養液后，加入DMSO 100 μL終止反應，繼續孵育30min，待結晶完全溶解后，490nm波長下用全自動酶標儀測定各孔OD值。細胞增殖抑制率計算公式：抑制率(％)=(實驗組OD值/對照組0D值)×100％。
 
    1.5 流式Annexin V／PI法檢測細胞凋亡
    細胞作用后，以1：4稀釋Binding buffer(50ml Buffer+150 ml蒸餾水)重懸細胞，并坷整細胞濃度lx106 ／m1．取95μl細胞懸液加入1μL Annexin V-FITC，室溫孵育30min加入2μLPI，室溫孵育10min，上流式細胞儀檢測。

    1.6 Caspase活性檢測
    Caspase-3、Caspase-8活性測定是依據色敏底物DEVD-pNA(對硝基苯胺)被活化的Caspase-3剪切后產生的 pNA單體，在400 nm波長的光密度(A)值而測定。細胞作用48h后，按照試劑盒說明書操作，測定A值。以 A400值表示Caspase-3、Caspase-8活性大小。

    1.7 Western-Blotting方法檢測HepG2細胞的Caspase-3、Caspase-8蛋白的表達水平
    將細胞培養于10 cm的培養皿中，藥物作用 48h后，用細胞刮刀將細胞刮下，加入100L細胞裂解液冰上裂解30min。所得裂解液于4℃下12000 r／min離心機離心10min。取清液加入1／4體積的5xSDS蛋白加樣緩沖液．煮沸10 min。所得蛋白樣品經12％SDS-PAGE分離后，電轉至硝酸纖維素膜上，以5％的脫脂奶粉37℃封閉2h后，依次加入一抗(室溫2h，PBS／T洗2次)、羊抗兔二抗(室溫2h，PBS／T洗2次)，ECL暗室中顯色。運用Bioimagining System成像分析系統觀察Westem-B1otting結果，對反應條帶灰度掃描并進行半定量分析。

    1.8 統計學處理
    采用 SPSS11.0軟件處理系統進行統計學分析。實驗數據以x+s表示。統計學方法采用F檢驗、Pearson相關分析，組內比較采用配對樣本t檢驗，組間計量資料均數比較用方差分析，P<0.05．差異有統計學意義。

    2 結果
    2.1 GLPS對肝癌細胞HepG2增殖的影響
    GLPS對肝癌細胞HepG2增殖的影響見表1 。MTT結果顯示：單獨使用氟尿嘧啶對HepG2細胞的增值抑制較低，GLPS 1μg/ml、10 μg/ml、100μg/ml 3個劑量與氟尿嘧啶 50μg/ml聯合使用對HepG2細胞增殖較單獨使用氟尿嘧啶的B組細胞均有顯著抑制作用(P<0.05)，抑制作用隨藥物濃度增高而有加強趨勢，最高抑制率可達34.8％，且3個劑量組間比較，P<0.05，差異有統計學意義。

 

 

 

    2.2 GLPS作用后肝癌細胞HepG2的細胞凋亡
    流式細胞儀 Annexin V／PI法檢測肝癌細胞HepG2在藥物作用48h后的凋亡百分率。結果顯示單獨使用氟尿嘧啶的B組細胞未發生明顯的凋亡(P>0.05)，而聯合使用GLPS的處理組細胞，凋亡的細胞明顯增加，見圖1，且隨著GLPS使用濃度的增大，凋亡細胞的比例也有所上升(P<0.05)。

    2.3 HepG2細胞的Caspase活性
    細胞作用48h后測定對照組及各處理組Caspase-3、Caspase-8酶活件的A400值，圖2。結果顯示，與對照組比較，單獨使用氟尿嘧啶的B組細胞Caspase酶活性無統計學意義(P＞0.05)，而聯合使用GLPS的處理組細胞Caspase-3、Caspase-8 酶活性顯著升高(P<0.05)，且GLPS低濃度使用時Caspase-8酶活性顯著升高，隨著GLPS使用濃度的增加，Caspase-3酶活性逐漸增強。

 

 

 

    2.4 HepG2細胞的Caspase-3、Caspase-8、線粒體細胞色素C蛋白的表達
    與對照組比較，單獨使用氟尿嘧啶的B組細胞Caspase-3、Caspase-8、線粒體細胞色素C蛋白的表達，P>0.05，差異無統計學意義，如圖3；而聯合使用GLPS處理的各組細胞的蛋白則有顯著變化，GLPS低濃度使用時線粒體細胞色素C、Caspase-8蛋白表達顯著升高。隨著GLPS使用濃度的增加，Caspase-3蛋白表達也逐漸增強，與β-actin相比的相對表達量見圖4。 

 

 

 

    3 討論
    靈芝多糖是從靈芝中提取的一種新內源活性物質，其所含的化學成分能夠顯著提高吞噬細胞的吞噬能力，增強體液免疫和細胞免疫功能，還能提高紅細胞中超氧化物歧化酶SOD活性，對人體具有顯著的抗腫瘤、抗癌作用。靈芝多糖抗腫瘤活性能是通過其對免疫活動或對宿主功能的影響而介導的，且水溶性多糖能起著更重要的作用。HepG2細胞具有典型肝癌細胞的一系列惡性特征，是研究和評價防治肝癌藥物的較理想的細胞模型。

    本實驗采用MTT法測定細胞活性，并計算細胞增值抑制率。研究結果表明，GLPS 1、10、100μg/ml 3個有效藥物濃度與常規化療藥物氟尿嘧啶50 μg/ml聯合使用對HepG2細胞增殖有顯著抑制作用，其最大抑制率可達34.8％，提示GLPS能在一定程度上抑制人肝癌細胞的增殖以延緩肝癌的進程。

    細胞凋亡是不同于細胞壞死的一種特殊的細胞死亡形式。細胞凋亡信號能引起線粒體細胞色素C釋放，作為凋亡誘導因子，細胞色素C能與Apaf-1、Caspase-9前體、ATP／dATP 形成凋亡小體 (apoptosome)，進而引發Caspase級聯反應。

    凋亡程序的啟動及執行過程中，Caspase-3是Caspase級聯反應中最關鍵的效應蛋白酶，通常以酶原的形式存在，激活后通過酶解其特異性底物，使細胞發生凋亡。本次實驗發現，GLPS與氟尿嘧啶聯合作用48h后，肝癌HepG2細胞中Caspase-3、Caspase-8酶活性明顯升高，Western-Blotting實驗證實，低濃度GLPS與氟尿嘧啶聯合作用組，Caspase-8、細胞色素C蛋白表達顯著升高，而隨著GLPS濃度升高，Caspase-3蛋白表達量亦逐漸升高，而單獨使用氟尿嘧啶時與對照組比較，差異無統計學意義。由此筆者認為GLPS與氟尿嘧啶聯合作用可能會誘導HepG2細胞釋放細胞色素C，引起Caspase的級聯反應，從而進步導致HepG2細胞的凋亡。本實驗通過Annexin V／PI流式細胞儀檢測，證實GLPS與氟尿嘧啶聯合作用后，HepG2細胞發生了顯著的凋亡。

    由此，我們推斷靈芝多糖可能與化療藥物存在一定的協同作用，聯合使用有較好的抗腫瘤效應，可能成為有效的腫瘤化療輔助藥物，有重要的研究意義，具有一定的運用前景。

 

(收稿日期：2009-10-13)