復(fù)方紅豆杉膠囊對(duì)雞胚絨毛尿囊膜血管生成的影響

    復(fù)方紅豆杉膠囊是中藥復(fù)方制劑，由紅豆杉、紅參、甘草3味中藥組成，適用于肺癌、胃癌、大腸癌、肝癌、口腔癌等中晚期癌癥的治療［1～3］，對(duì)放化療有增效作用。復(fù)方紅豆杉膠囊臨床上抗腫瘤作用療效確切，但是否具有抑制腫瘤血管生成的作用，目前尚未見報(bào)道。本研究利用雞胚絨毛尿囊膜法觀察復(fù)方紅豆杉膠囊對(duì)血管生成的影響。

    材料與儀器

    1.1 藥品與試劑復(fù)方紅豆杉膠囊（重慶賽諾生物藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：090301）；硫酸魚精蛋白注射液（上海第一生化藥業(yè)有限公司，批號(hào)：080102）；新潔爾滅（南昌白云藥業(yè)有限公司，批號(hào)：080501）；水合氯醛（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)041210）；丙酮（南京化學(xué)試劑廠，批號(hào)：990407）；甲醇（江蘇漢邦科技有限公司）。

    1.2 動(dòng)物清潔級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（許可證號(hào)：20080033）。新鮮種蛋，產(chǎn)出兩天內(nèi)用于實(shí)驗(yàn)，蛋重50～60 g，由南京市六合區(qū)黃木橋孵化場(chǎng)提供。

    1.3 儀器AIR TECH超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)安泰公司）；Forma series ⅡCO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）；光學(xué)顯微鏡（重慶光學(xué)儀器廠）。

    方法

    2.1 含藥血清的制備清潔級(jí)雄性SD大鼠，常規(guī)飼養(yǎng)。復(fù)方紅豆杉膠囊低劑量和高劑量分別按成人（60 kg）體重的6倍（180 mg/kg）和12倍（320 mg/kg）灌胃給藥,空白血清組大鼠每天灌胃相同體積的蒸餾水。以上各組灌胃1次/d，連續(xù)灌胃7 d。于末次灌胃2h后，水合氯醛麻醉（35 mg/kg），腹主動(dòng)脈取血，3 000 r/min，10 min離心，取上層血清。無(wú)菌濾器（直徑0.2 μm）過(guò)濾除菌，密封，-20℃保存。

    2.2 CAM模型的制備

    2.2.1 種蛋的孵育選擇產(chǎn)出2d內(nèi)的新鮮種蛋，先用溫水清洗2次，再用1∶1000的新潔爾滅清洗表面，最后在超凈臺(tái)內(nèi)用75%酒精擦拭表面，放入無(wú)菌培養(yǎng)箱孵育，設(shè)定溫度在37℃，濕度在40%～60%。種蛋大頭朝上，45°傾斜。為促進(jìn)羊膜運(yùn)動(dòng)，防止胚胎發(fā)生粘連，每天翻蛋4次。

    2.2.2 雞胚的檢查使用聚光燈源，自制照蛋燈。每天觀察胚胎發(fā)育情況，隨時(shí)淘汰未受精、死胎及胚胎發(fā)育不良的種蛋。

    2.2.3 假氣室的制備種蛋孵育至第7天，無(wú)菌條件下，在種蛋氣室端打一個(gè)1～2 mm的小孔，滴加50 μl生理鹽水使雞胚絨毛尿囊膜下陷，洗耳球從小孔處吸氣，使雞胚絨毛尿囊膜與殼膜分離，用彎頭鑷剝?nèi)サ皻ら_窗（約1.0 cm×1.0 cm），去除殼膜，制成假氣室。用滅菌透明膠密封開窗處，繼續(xù)孵育24 h。

    2.3 藥物對(duì)CAM的作用隨機(jī)分為生理鹽水組，硫酸魚精蛋白組，空白血清組，復(fù)方紅豆杉膠囊低高劑量組5組。開窗24 h后，超凈臺(tái)內(nèi)揭去透明膠，將滅菌好的擦鏡紙片作為載體放在CAM的血管最少處，每枚種蛋加藥量為10 μl，將其輕輕加到載體上。加藥后，用透明膠封閉窗口，標(biāo)記后繼續(xù)孵育。48 h后，記錄雞胚存活率，揭去透明膠，固定液（乙醇∶丙酮1∶1）固定15 min，以載體為中心，剪下CAM，水中展開后，鋪于濾紙上，拍照，顯微鏡下觀察血管數(shù)。以載體為中心，1 mm以內(nèi)為一級(jí)血管，5 mm內(nèi)為二級(jí)血管，一、二級(jí)血管分別觀察分析。

    2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)以±s表示，進(jìn)行組間t檢驗(yàn)。

    結(jié)果

    3.1 復(fù)方紅豆杉膠囊對(duì)雞胚存活率的影響

    復(fù)方紅豆杉低、高劑量組血清作用于CAM后，對(duì)雞胚的存活率未見明顯影響。

    3.2 復(fù)方紅豆杉膠囊對(duì)CAM血管形態(tài)的影響 

    生理鹽水組和空白血清組血管生長(zhǎng)正常，硫酸魚精蛋白組、復(fù)方紅豆杉膠囊低、高劑量組血管計(jì)數(shù)明顯減少，血管顏色蒼白、變淺，載體放置部位無(wú)血管生成。

    3.3 復(fù)方紅豆杉膠囊對(duì)CAM血管生成的影響

    硫酸魚精蛋白組、復(fù)方紅豆杉膠囊低、高劑量組明顯抑制血管的生成，與生理鹽水組、空白血清組相比，有顯著性差異（P<0.01）。

    討論

    血管生成是指從已存在的血管中長(zhǎng)出新的毛細(xì)血管的過(guò)程。腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移都依賴于新生血管的形成。新生血管為腫瘤的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)和排出廢物，刺激腫瘤生長(zhǎng)，促使腫瘤向其他組織器官轉(zhuǎn)移。原發(fā)灶血管數(shù)量的增多，增加了腫瘤轉(zhuǎn)移的可能性，即新生血管形成與腫瘤的轉(zhuǎn)移傾向呈正相關(guān)。因此，抑制腫瘤血管生成已成為近年來(lái)控制腫瘤生長(zhǎng)和抗腫瘤轉(zhuǎn)移研究中的熱點(diǎn)之一。

    復(fù)方紅豆杉膠囊由紅豆杉、紅參、甘草三味中藥組成。紅豆杉的提取物紫杉醇是治療轉(zhuǎn)移性卵巢癌和乳腺癌的有效藥物之一。研究表明紫杉醇對(duì)血管生成有很強(qiáng)的抑制效應(yīng)，證實(shí)紫杉醇是一種血管生成抑制因子。紫杉醇能夠明顯抑制裸鼠肝癌的血管生成，是一種極其有效的化療藥物。其作用機(jī)理可能是通過(guò)與微量蛋白結(jié)合，促進(jìn)其聚合，抑制細(xì)胞的有絲分裂，有效地阻止腫瘤細(xì)胞的增殖。

TAG：復(fù)方紅豆杉膠囊｜雞胚絨毛尿囊膜｜血管生成