內源性血管生成抑制劑

JUDAH FOLKMAN

APMIS 112: 496–507, 2004

2004 年2 月，FDA 委員宣布認可Avastin 作為結腸癌患者的治療方法，稱血管生成抑制劑是抗癌治療的第四種方案。與傳統化療相比，血管生成抑制劑毒性小，且發生耐藥的危險性低，他們代表了新種類的抗癌藥物，其中一些抑制劑的毒性被充分的降低，所以長期使用是安全的。包括免疫治療、疫苗、端粒酶抑制劑、細胞死亡誘導劑、低劑量metronomic 化療、新穎的激素治療、基因治療和其他。在循環和/或細胞外基質中至少發現了16 種內源性血管生成抑制劑。血管生成抑制劑的應用可能會變成最安全、毒性最小的抗癌治療法。四種血管生成抑制劑已經應用于治療腫瘤的臨床試驗中。目前，有報道口服一些小分子（FDA已認可他們的其他用處），能明顯增加人體和老鼠中至少兩個內源性血管生成抑制劑水平，人體中為內皮抑素、老鼠中為血小板反應素。該發現提示未來一些新的臨床應用，包括通過目前正在發展的血液或尿液中的生物標記指導血管生成抑制劑的使用，這些生物標記能在腫瘤表現出癥狀之前或可用常規方法找到腫瘤之前發現腫瘤的存在。

關鍵詞：內源性血管生成抑制劑；血管生成抑制劑；抗血管生成治療；metronomic化療

美國食品藥品協會已認可血管生成抑制劑為癌癥的治療方法，那我們應該考慮這些新的治療性因子未來的應用。在三種常見的血管生成抑制劑中，那些作用于單個血管源性介質如VEGF 的抑制劑，當與其他血管生成抑制劑或與低劑量的metronomic 化療一起給藥時可能有效。因為相對于傳統的化療，血管生成抑制劑的毒性較低，并且發生耐藥的危險性較低，所以運用血管生成抑制劑治療可能超越傳統化療。比如，在腫瘤表現出癥狀之前或用常規的方法可以局限住腫瘤前，如果血液或尿中的生物標記可以診斷出癌癥的存在，那這些副作用最小的血管生成抑制劑會是最適合的治療選擇。這并不是指預防癌癥的唯一方法是抗血管生成治療。然而抗血管生成治療被認為是新型的抗癌方法，其中的一些毒性充分的減少，長期使用是安全的。包括免疫療法、疫苗、端粒酶抑制劑、凋亡誘導劑、新穎的激素療法、基因療法及其他。所有抗癌治療方法中最安全、毒性最小的可能是內源性血管生成抑制劑。他們是本文的討論重點。

血管生成抑制劑：從實驗室到臨床應用

1971 年發表了關于腫瘤生長是血管生成依賴性的假說，這開始了人們對于血管生長過程的研究[1，2]，最終吸引了全世界上千萬的研究者。1973 年內皮細胞首次在活體外傳代成功[3，4]，隨后發展了血管發生的生物學鑒定方法[5，6]，發現了血管源性蛋白以及首個血管生成抑制劑[11-19]，血管源性蛋白包括成纖維細胞生長因子bFGF, aFGF [7，8],血管內皮細胞生長因子VEGF[10],血管通透性生長因子VPF[9]及其他[6]。1988 年，一個患威脅生命的肺多發性血管瘤的患者第一個接受了抗血管生成治療，目前身體健康[11，12]。整個90年代，開始了應用每天低劑量α干擾素治療患威脅生命的血管瘤的兒童和患成血管細胞瘤和高級別的巨細胞瘤的各種年齡的患者[20-23]。1994 年有報道反應停是一種血管生成抑制劑[19]，1999 年報道反應停首次成功用于臨床治療多發性骨髓瘤[24]。2004 年2 月，FDA 認可了Avastin，Avastin 是在大樣本、多中心、隨機、安慰劑對照的臨床試驗中被證實的第一個血管生成抑制劑，可延長轉移性結腸癌患者生存率[25]。關于血管生成的臨床試驗和基礎研究都在繼續開展。自1971 年起，有超過20000 的關于血管生成的文章發表。在美國，有超過30 種的血管生成抑制劑正在進行癌癥治療的臨床試驗，也見于關于黃斑變性和糖尿病視網膜變性的臨床試驗，不包括全世界已經在用的其他血管生成抑制劑[圖一]。

歸納一下，這些血管生成抑制劑可分為兩類，一些專門抗血管生成的，如Avastin，VEGF-Trap，另一些除了抗血管生成的功能外還有其他功能（稱多效的）。事實上，一些多效的血管生成抑制劑在被發現他們有抗血管生成的功能前已被FDA 認可了其他的功能，如塞來考昔（抗關節炎藥，COX-2 抑制劑）。其他的也已在研究者發現他們的抗血管生成的功能前被用于臨床試驗。然而，在FDA 認可他們時，他們的抗血管生成的功能還沒有被臨床醫師廣泛了解。比如Velcade，是一種蛋白體抑制劑，但在動物模型中具有有效的抗血管生成的功能[26-28]。Iressa 和Erbitux，在腫瘤細胞中阻斷EGF 受體酪氨酸激酶的功能已被FDA認可。該功能導致了腫瘤細胞表達VEGF, bFGF,和 α-TGF 下降[29]。目前在臨床試驗中發現Tarceva 有類似的作用。跟在腫瘤細胞中一樣，ZD6474 在內皮細胞中也阻斷了EGF 受體酪氨酸激酶。α-TGF 上調了內皮細胞受體[30]。對目前已發現的抑制血管生成的藥，抗血管生成的機制尚不清楚。例如，在反應停被證實在小鼠角膜上可抑制血管生成之后[19]，后續有報道反應停在多發性骨髓瘤病人中，也可以減少VEGF 的表達并減少循環中過度生產的內皮細胞前體物質至正常水平[31，32]。

圖1 一些正在進行臨床試驗或已得到美國FDA 批準的血管生成抑制劑。左側列包括那些只有單一功能的血管抑制藥物。右側列包括除了抗血管生成功能外還有其他功能的藥物。其中九種在發現還具有血管生成抑制作用前是因為其他的活性而被FDA 批準。西樂葆[71，72]和唑來膦酸[78]是其中的例子。

目前臨床上血管生成抑制劑的類型

為了區別用于患者的血管生成抑制劑如何不同，我們定義了三種常見類型的血管生成抑制劑[圖二]。Ⅰ型抑制劑阻斷單個血管源性蛋白，如Avastin 中和了由腫瘤細胞和/或瘤床上的基質細胞產生的VEGF。VEGF 是抗血管生成治療的一種有效靶因子，大約60%的人體腫瘤產生VEGF。然而，當腫瘤病人生存時間更長時，由于腫瘤細胞突變，可能會有過多的血管源性蛋白出現的危險。如第一次診斷時大多數乳腺癌只產生VEGF，而其他的乳腺癌特別是復發性腫瘤，產生多至五種其他的血管生成因子[33]。因此，隨著時間的發展，一些Ⅰ型血管生成抑制劑可能出現獲得性藥物耐藥。然而，這似乎是由腫瘤或他相關的基質細胞產生的另外的血管源性蛋白導致的，這些蛋白不是Ⅰ型血管生成抑制劑的作用對象。通過在開始時聯合其他血管生成抑制劑或聯合抗血管生成化療（低劑量或metronomic 化療），可避免這種對Ⅰ型血管生成抑制劑的無應答性的現象[34-36]。傳統化療也可聯合抗血管生成治療，但最大耐受劑量的化療使組織因子的表達增加，超過了在腫瘤病人中的正常高值。這個方案中附加的抗血管生成治療可能與血栓性疾病和心肌梗塞的危險性上升相關[37，38]。

圖2 依據是否抑制一種或是多種血管生成蛋白，血管生成抑制劑的一種可行的分組方法Ⅱ型血管生成抑制劑阻斷兩種或三種血管源性蛋白。例如，Iressa 阻斷腫瘤細胞產物VEGF, bFGF,和 α-TGF，而Sugen5416 阻斷VEGF 受體。這些抑制劑聯合其他血管生成抑制劑給藥或聯合低劑量metronomic 化療給藥效果會增加。Ⅲ型血管生成抑制劑是具有廣譜抗血管源性蛋白功能的。如TNP-470，一種煙曲霉素的類似物，可能具有最廣的抗癌活性，它具有任何一種血管生成抑制劑的活性。超過400 篇報道顯示在裸鼠、老鼠、倉鼠和兔子上的超過84 種不同類型的腫瘤，包括長在裸鼠身上的人腫瘤，40%-100%被抑制。這種抑制劑在臨床Ⅰ期試驗中非常有效，但在高劑量時有神經毒性，所以在Ⅱ期試驗中未繼續下去。然而，現在將它與一聚合物（羥丙基異丁烯酰胺）結合后，顯示無毒性且更有效[39]。內皮抑素是一種內源性血管生成抑制劑，其在血管內皮上的功能性的受體是α5β1[40，41]，但內皮抑素似乎也通過減少再生內皮細胞中αⅤβ3 整連蛋白抑制腫瘤。還顯示自己注射抑素他丁超過2.5 年的患者未出現內皮抑素毒性，那些轉移性的疾病依然穩定或緩慢復原。

總之，血管生成抑制劑可抑制腫瘤細胞產生血管源性蛋白（如Iressa、Erbitux、α干擾素），或阻斷受體與這些蛋白的相互作用，或中和蛋白本身，或直接作用于腫瘤床微血管內皮細胞，通過其他機制抑制遷移和增殖（如內皮抑素）[42]。

內源性血管生成抑制劑

在70 年代晚期，本實驗室長期致力于證實血管生成抑制劑的存在，因為幾乎沒有科學家相信此種分子的存在。從1980-2003 年，我們先后報道了11 種血管生成抑制劑。5 種新發現的分子和6 種先前未發現其抗血管生成功能的分子[圖三][11-19，43-45]。其中的五種目前已用于臨床試驗中的不同階段，其中的八種是內源性血管生成抑制劑。

圖3 1980 年到2003 年在Folkman 實驗室發現的11 種血管生成抑制劑。

1980 年，本實驗室中的Bruce Zetter 首次揭示α干擾素在劑量依賴下，能可逆的抑制內皮細胞遷移[13]。這導致了其后來被稱為血管生成抑制劑[46，47]。1988 年[11，12]，α干擾素成功的用于完全或持久復原威脅生命的肺血管、腦血管瘤、嬰兒氣道或肝的血管瘤、對傳統治療耐受的復發性的高級別的巨細胞瘤和成血管細胞瘤[20-23][48-50]。這些腫瘤都表達高水平的bFGF 作為他們主要的血管源性中介物。α干擾素抑制bFGF 產物訊息和人癌細胞產生的蛋白[51]。β干擾素，商業上有效的α干擾素的活體內副本，是第一個被發現的內源性血管生成抑制劑。目前至少有15 種這樣的內源性抑制劑[圖四]。

圖4 目前所知內源性血管生成抑制劑。

然而，我們不能立刻識別這些分子有內源性血管生成抑制劑的潛在功能，直到后來發現了血管抑素[17]。血管抑素作為體內一更大蛋白（纖維蛋白溶酶原）的片段，是第一個被發現的內源性血管生成抑制劑。內皮抑素作為基質蛋白——膠原ⅩⅧ的內部的片斷，是第一個被發現的內源性血管生成抑制劑[18]。見引文中的綜述[6]。

內源性血管生成抑制劑預防病理性血管發生的遺傳學證據

一些研究證實了體內的血管生成抑制劑能幫助抑制病理性血管發生[52，53]。波斯頓Beth Israel 醫院的Raghu Kalluri 和他的同事報道了令人矚目的證據。他們發現tumstatin，膠原Ⅳα鏈上的一個232 氨基酸多肽，能有效的抑制血管生成[54]。在膠原Ⅳ上α3 鏈缺如的動物身上，正常血中tumstatin 水平為0 ng/ml -336+-28 ng/ml。腫瘤種植在tumstatin 缺如的老鼠身上，生長速度比在野生型老鼠身上快3-4 倍。然而，如果tumstatin 換回到生理學水平，在α3 鏈缺如的老鼠身上腫瘤生長速度減慢，比野生型老鼠還慢。這顯示在野生型老鼠中腫瘤不是升級速率生長的，但他們的生長率被內源性tumstatin 部分抑制。若加入藥理學劑量的tumstatin，腫瘤生長明顯被抑制，并低于腫瘤在野生型老鼠上的生長速度。除了tumstatin是單純的抗血管生成、至今不知道其他功能之外，這驗證了經典的觀點：腫瘤抑制蛋白如p53。此外，在tumstatin 缺如的老鼠身上比野生型老鼠身上的循環內皮細胞水平高10 倍，但加入tumstatin 替代可降至正常水平[55]。發現αⅤβ3 是tumstatin 的功能性整合蛋白[42]，α5β1 是內皮抑素的功能性整合蛋白[41，42]。Tumstatin 抑制來自αⅤβ3+/+的老鼠的內皮細胞中DNA 的合成，但不能抑制來自αⅤβ3-/-的老鼠的內皮細胞中DNA 的合成。內皮抑素在兩種老鼠系中都可以抑制DNA 的合成。在皮下植入基質膠，發現相似的反應發生，對抗VEGF 導致的血管生成。Tumstatin 抑制血管生成作用只出現在β3+的老鼠中，但在β3-的老鼠中無該作用，而內皮抑素在兩種老鼠系中都可以抑制血管生成。在另一個實驗中，在金屬蛋白酶-9 缺失的老鼠中，因為金屬蛋白酶-9 間接的從膠原Ⅳ上將Tumstatin 分裂出來，Tumstatin 血液水平被降低了約40%。在這些老鼠中，植入的腫瘤生長明顯增快，但如果tumstatin 替代到生理學水平，腫瘤生長減低到比在野生型老鼠中更慢。總之，當血管生成抑制劑被阻斷，或他的受體被阻斷或從他的基質蛋白釋放配基的酶被阻斷，所有操作可預知的顯示同樣的效應：血管生成增加、腫瘤生長增加、tumstatin 替代到生理學水平后腫瘤生長速度可恢復至在野生型老鼠中的水平。血小板反應素-1 是一種內源性血管生成抑制劑。在血小板反應素-1 缺失的老鼠中腫瘤生長速度明顯快于在野生型老鼠中[56]。因此，內源性血管生成抑制劑，如p53，在正常情況下可能對腫瘤提供另外的預防。事實上，p53 通過四種不同的機制抑制血管生成。1.上調血小板反應素-1 的表達[57]2.降低缺氧誘導因子-1-[58]3.抑制VEGF 表達4.下調bFGF 關聯蛋白表達[60]。

內源性血管生成抑制劑可能有腫瘤抑制基因功能的臨床證據

Down 綜合癥的患者即使存活到中年或更老，他們實體腫瘤的發病率也非常低[61]。在美國，對17897 名Down 綜合癥患者進行人口調查研究，所有實體癌的發生率低于0.1，除了睪丸癌是跟正常人群同樣概率。在兒童中白血球過多癥的發病率增加。由于21 三體中膠原ⅩⅧ三倍體的出現，Down 綜合癥的患者也有明顯的高水平的循環內皮抑素。正常受試者血清內皮抑素濃度為20+-11 ng/ml，相對的，Down 綜合癥的患者中為39+-20 ng/ml。作者總結，“增加正常內皮抑素量的1/3 可能是有效的治療劑量，可明顯的抑制許多實體腫瘤”。糖尿病性視網膜病在Down 綜合癥的患者中少見[63]，動脈粥樣硬化也少見[64]。有報道在載脂蛋白E 缺失的小鼠中，動脈粥樣硬化的斑塊的生長依賴于這些斑塊的新生血管的形成。運用內皮抑素，相對于未治療組，可抑制高達85%的斑塊生長。遺傳缺失膠原ⅩⅧ，并后續缺失內皮抑素，增加了動脈粥樣硬化中新生血管的形成和脈管的通透性[66]。VEGF 增加了血管內皮細胞中神經鈣蛋白的表達[67]，但VEGF 也增加了Down 綜合癥關鍵區蛋白-1 的表達，該蛋白下調了神經鈣蛋白的表達，因此有中和VEGF 導致的神經鈣蛋白表達增加的傾向。上調神經鈣蛋白的表達對內皮細胞增殖是必要的。可以設想內皮抑素下調內皮細胞中的神經鈣蛋白的表達，VEGF 刺激的Down 綜合癥關鍵區蛋白-1 也部分介導內皮細胞中的神經鈣蛋白的表達，因此在Down 綜合癥中可能有另一個復制。

內源性血管生成抑制劑能增強藥理性嗎？

來自Down 綜合癥患者的資料顯示，循環的內皮抑素水平可能與遺傳學有關。這提出了問題：用小分子特別是用口服的有效的小分子是否可能導致圖四中列出的任何一種內源性血管生成抑制劑的增加。多次低劑量化療給藥能增加內源性血管生成抑制劑，該效應是獨立于用藥的。該研究是我們實驗室的Timothy Browder 開始的[34]。Browder 報道指出當開始治療癌體積為100-650mm3 的路易斯肺癌時，傳統的化療如按傳統的最大耐受劑量計劃表給予環磷酰胺，為保證骨髓的修復治療間隔為三周，這導致了在所有腫瘤對藥的耐藥[34]。相反的，當更頻繁，更低劑量給予環磷酰胺治療時，他的作用如同血管生成抑制劑。在腫瘤細胞細胞死亡開始的前4 天，腫瘤血管床增殖的內皮細胞經歷一段細胞死亡的波動。所有腫瘤完全退化，動物保持無腫瘤狀態，擁有正常壽命（高達657 天）。當腫瘤對環磷酰胺耐藥時，與傳統方案（最大劑量）給予環磷酰胺相比，仍然有明顯的腫瘤抑制作用。當加入另一個血管生成抑制劑TNP-470 時，有持久的腫瘤退化，貫穿了動物的正常生命期。相反的，所有用傳統方案（最大劑量）給藥——環磷酰胺的動物死于腫瘤耐藥。該研究由多倫多Robert Kerbel 的實驗室證實，他們用不同的化療治療藥物，長春堿，聯合不同的血管生成抑制劑DC101 給藥。DC101 是VEGF 受體2 的抗體[36]。換句話講，抗血管生成化學治療如頻繁、低劑量給予環磷酰胺，導致腫瘤床微血管內皮細胞優先死亡 ，優化了藥物的抗血管生成能力，降低了藥物的毒性，事實上消除了獲得性的環磷酰胺耐藥的發生。在另一個實驗中，當小鼠接受給予劑量的內皮抑素，用滲透泵超過24 小時連續給藥。其抑制人胰腺癌生長的有效性是一次性給予同樣大劑量治療方案的10 倍[68]。事實上，腫瘤退化只有在連續給藥時才會達到。頻繁、低劑量的化療可能與暴露腫瘤床內皮細胞以持續的內皮抑素治療相似。Browder 稱該方法為抗血管生成治療，暗示可通過改變劑量和給藥時間使化療藥物的抗血管生成活性達到最大。在一篇評論中，Douglas Hanahan 創造了術語metronomic 治療以指明新的治療方案。該術語現在已被廣泛運用。許多種關于抗血管生成的臨床試驗，低劑量化療目前正在進行中[69]。隨后，Kerbel 實驗室在移植有腫瘤的老鼠的飲用水中加入低劑量metronomic 環磷酰胺，證實95%的腫瘤生長被抑制，這些腫瘤生長與循環血小板反應素-1明顯增高相關[70]。在血小板反應素-1 缺乏的小鼠中低劑量metronomic 化療是無效的，這提示低劑量口服化療部分依賴于其導致循環血小板反應素-1 增加的能力。這個結果使我質疑：是否其他任何經口服釋放的小分子都能導致循環內源性血管生成抑制劑水平的增加。如果某一個內源性血管生成抑制劑在血液中能被增加，那將模擬持續給予抑制劑治療。有報道塞來考昔是血管生成抑制劑[71]。隨后，有報道塞來考昔和羅非考昔通過自血小板中釋放內皮抑素增加循環內皮抑素[72]。低劑量doxycyline，而不是四環素，在抗酸轉染的人腫瘤細胞中增加了血小板反應素-1[73]。Doxycyline 與威脅生命的肺血管內皮細胞瘤的完全退化相關[50]。羅格列酮，一PPAR(過氧化物酶體增生物激活受體)γ配基，也被報道可導致循環血小板反應素-1 以及他的受體CD34 增加[74，75]。此外，關節炎的標準治療，柳氮磺胺吡啶和氫化潑尼松，導致了滑膜關節中內皮他定的增加和VEGF 的減少。

歸納起來，至少五種小分子（他們在其他疾病的廣泛運用已全被FDA 認可）能增加內源性內皮他定或血小板反應素-1 的水平[圖五]。我已經報道對移植有腫瘤的老鼠給藥——羅格列酮，可預防初發腫瘤切除后的肺部轉移腫瘤的生長[75]。因此，應該慎重考慮在重度聯合免疫缺陷病免疫耗竭患者中，是否可通過提高循環內源性血管生成抑制劑水平逆轉或是預防腫瘤生長。

圖5 口服給藥的小分子化合物（它們都是FDA 批準的，沒有相關毒性）提高血液循環中某些內源性血管生成抑制劑的圖解。這一圖示也揭示了發現一些小分子的可能，它們可以提高如alphastatin、TIMP-2 和tumstatin 這一列表中其他血漿內源性血管生成抑制劑的水平。為預防非血管源性原位腫瘤向血管源性腫瘤的轉變或為了治療在癥狀出現數年前顯微鏡下血管源性腫瘤，增加內源性血管生成抑制劑可能是長期抗癌治療中最安全的方法。在不久的將來，當生物標記能在腫瘤未擴散前檢測出腫瘤的存在（如引文[76]和[77]中的原型），增加內源性血管生成抑制劑的治療方法將變得可行。生物標記可指導這種新奇的治療方式，而不需要等到腫瘤長到傳統的成像法能檢測到的大小。生物標記目前用于來自心臟病學的模型，如血漿膽固醇和C 反應蛋白，來指導抑制素治療動脈粥樣硬化，而不需要知道斑塊的解剖學定位。

文獻：參照原文