蘇肽生注射用鼠神經生長因子對猴基底前腦神經元的保護作用

    神經病理和神經化學研究表明，老年性癡呆(Alzheimer病)患者由于腦內神經生長因子(NGF)缺乏，其腦內乙酰膽堿的濃度和合成明顯降低，大腦皮質中出現老年斑，神經原纖維紊亂。由于NGF不能通過血腦屏障，本實驗將能分泌NGF的細胞微包囊植入腦室內，通過檢查移植后腦內基底前腦神經元的數量，來了解和確定NGF對基底前腦神經元的保護作用。

　　材料與方法

　　一、實驗動物

　　本組選用6只老年雌性恒河猴，年齡在24～29歲之間。

　　二、手術方法
　　用氯胺酮將動物麻醉后再行異氟烷全身麻醉，氣管插管，將頭置于定向儀架上固定。取頭頂部正中直切口，長約6 cm，牽開頭皮，在右矢狀竇旁用電鉆磨一骨瓣，形成一1.5 cm×4 cm大小的骨窗。瓣形切開硬腦膜，翻向中線側。在手術顯微鏡下牽開大腦縱裂，縱行切開胼胝體，從頂部打開側腦室，在Moron氏孔水平可見一白色束狀纖維即為穹隆，用一鈍性小鉤將其從底部鉤起，切斷。切斷穹隆并確定無出血后，立即將5根裝有能分泌人NGF的小牛腎纖維母細胞瘤細胞的多聚微包囊并排植入同側側腦室內。3只猴接受可分泌人NGF的細胞(實驗組)，另3只猴接受的移植細胞不能分泌NGF，作為對照組。然后復置骨瓣，逐層縫合。動物自然蘇醒。

　　三、組織學檢查

　　術后3～4周再次將動物麻醉，經原入路開顱，去骨瓣后在顯微鏡下取出微包囊，進行組織學和神經化學檢查。開胸，從左心室灌注生理鹽水，至右心房流出液清亮后，繼續灌注濃度為400 g/L苦味酸固定液。開顱，完整取出腦，置于300 g/L的高糖溶液中，冰箱內冷凍保存。腦組織塊脫水后，冰凍切片40 μm厚，分別進行尼氏染色和乙酰膽堿酯酶(AchE)、膽堿乙酰化酶(ChAT)、多巴胺β-羥化酶(DβH)、β-淀粉樣酶和低親和力神經生長因子受體(p75NGFr)的免疫組織化學染色 。

    結　　果

　　所有猴腦顳葉、頂葉、杏仁核和海馬內的切片均可見有大量的β-淀粉樣酶免疫陽性的斑塊樣結構，兩組動物的斑塊數量無差別。術后動物腦切片尼氏染色顯示，位于側腦室孔水平可見左側穹隆完全被切斷，導致同側海馬內的AchE陽性纖維較對側明顯減少。隔區免疫組織化學檢查顯示，對照組隔區p75NGFr陽性神經元較對側減少53%，殘余細胞呈萎縮狀，而實驗組只較對側減少7%～23%； 實驗組的ChAT免疫陽性神經元在隔區內計數比對側減少0～37%，而對照組則較對側減少57%～75%。實驗組的膽堿能陽性神經元的形態正常，而對照組的神經元顯示萎縮。實驗組在隔區內可見有膽堿能神經纖維及p75NGFr陽性神經纖維的發芽反應，而對照組則無此反應。有1只猴的1根微包囊被插入腦實質內，其NGF受體能陽性神經纖維在移植物周圍形成網狀。雖然這些神經纖維叢來自何處尚不清楚，但可以確定的是，這些纖維不是來自交感神經系統，因為這些纖維較細、迂曲，DβH免疫組織化學染色陰性。另外，在這些神經纖維叢內，也可見很少量的神經元，但由于其量太少，不可能形成網狀。每只動物腦內移植的細胞囊在移植前每24小時可分泌(44.65±0.95)ng的人NGF，從動物腦內取出后每24小時可分泌NGF 9.6 ng。

　　討　　論

　　本實驗表明，將能分泌人NGF的細胞囊移植到切斷穹隆的老年猴腦室內后，NGF對變性的老年靈長類動物的腦基底前腦神經元有營養效應和趨化效應。實驗用猴的年齡相當于人75～87歲，對照組可見基底前腦的膽堿能神經變性明顯，移植能分泌NGF的細胞后，有效地預防了膽堿能神經元的損傷和變性，還能誘導膽堿能神經纖維的發芽反應，在最老猴的腦內也可觀察到這種變化。結合過去我們在年青猴所做的實驗結果，可見這種效應在任何年齡的靈長類動物都是存在的。損傷和移植后，膽堿能神經元比神經生長因子受體能神經元對這種效應更敏感。

　　由于NGF不能容易地通過血腦屏障，微包囊移植可能成為一種有效的途徑。因為這種微包囊可使具有營養作用的小分子雙向通過，而免疫分子卻不能通過，所以異體移植時不用免疫抑制劑也可長期存活。在移植物周圍，只有很輕微的星形細胞增生，而微包囊內的細胞卻存活很好，且分泌功能存在。

　　NGF已被用于治療由于膽堿能神經元缺乏所引起的老年性癡呆病，Olson等對1例患者靜脈注射NGF，發現其記憶能力有所改善，而其它認識能力無改善。我們認為，在NGF廣泛應用于臨床之前，應當認真評價其在靈長類的效應、最佳劑量和給藥途徑。我們曾在年青猴的研究中發現，移植前后微包囊內的細胞分泌能力相當，但本實驗結果表明，移植數周后，微包囊內的細胞分泌能力下降，而此時仍對基底前腦神經元有影響，說明低水平的NGF即可成功地預防基底前腦神經元的變性，如果這種保護作用能持續存在，就可用這種方法來治療老年性癡呆。

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