慢性乙型肝炎病毒患者肝內(nèi)原位病毒學(xué)分析

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　　乙肝病毒是一種嚴(yán)重影響人類健康的病原體，也是引發(fā)慢性乙肝的元兇。根據(jù)國際衛(wèi)生組織2015年估計，全球約有2.4億慢性乙肝患者，大多分布在低收入及中等收入國家，每年約有78萬患者死于慢性乙肝感染所致的肝衰竭、肝硬化和癌。在中國，約有9300萬慢性乙肝感染者，其中，由乙肝病毒引發(fā)的肝硬化和肝癌患者比例分別高達(dá)60%和80%。隨著乙肝疫苗接種的推行，我國嬰幼兒的乙肝陽性率有了大幅度的降低。但是，對于其他感染者，依然缺乏徹底治愈的療法，并且給患者家庭帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和健康威脅。

　　大量臨床與基礎(chǔ)研究表明，慢性乙肝長期遷延不愈的根本原因在于乙肝病毒共價閉合環(huán)狀DNA （cccDNA）在肝臟內(nèi)的長期存在及其造成的病毒表面抗原血癥。由于cccDNA在慢性乙肝患者肝臟中的水平極低，傳統(tǒng)的分子生物學(xué)方法（如Southern印記、cccDNA特異性聚合酶鏈反應(yīng)）不僅檢測困難，而且無法顯示其在組織內(nèi)的分布特點(diǎn)。

　　鑒于目前對乙肝cccDNA研究存在的問題，來自復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點(diǎn)實驗室的Zhangxiaonan等研究者在bDNA信號擴(kuò)增技術(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)行二次開發(fā)，成功建立了一種能夠在組織水平顯示cccDNA分布的原位雜交技術(shù)。該技術(shù)還能顯示乙肝病毒的其他復(fù)制中間體，如前基因組RNA （pgRNA）、松弛環(huán)狀DNA（rcDNA）在單細(xì)胞水平的分布情況。研究者將該原位雜交技術(shù)與乙肝病毒主要抗原的免疫組化染色相結(jié)合，獲得了病毒核酸與蛋白同時存在的圖像。令人意外的是，乙肝病毒抗原與核酸在單細(xì)胞水平呈現(xiàn)驚人的馬賽克狀分布，即病毒的ccc DNA、RNA與表面抗原均顯示顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。本研究還進(jìn)一步證實，經(jīng)過一年以上抗病毒治療的患者的肝細(xì)胞內(nèi)仍存在乙肝病毒的ccc DNA。綜合前期研究，本研究基于大量患者樣本的觀察結(jié)果，提出在單細(xì)胞水平乙肝病毒存在抗原富集期、DNA富集期和潛伏期的三階段假說，推測患者體內(nèi)肝細(xì)胞生理水平和病毒復(fù)制活躍度的變化可以導(dǎo)致這三個階段的相互轉(zhuǎn)換。該假說從單細(xì)胞水平描述了病毒生活周期的復(fù)雜變化模式，豐富了學(xué)術(shù)界對乙肝病毒在肝內(nèi)存活的認(rèn)識，為進(jìn)一步針對不同病情患者清除乙肝病毒ccc DNA的新策略提供了理論基礎(chǔ)。

　　其中，HBsAg 和 HBcAg的免疫組化及免疫熒光實驗由奧地利TG公司的TissueFAX系統(tǒng)采圖，TissueQuest軟件分析，該研究建立的乙肝病毒cccDNA原位雜交技術(shù)，不僅對基礎(chǔ)研究具有較大意義，同時也具有廣闊的應(yīng)用前景。該方法可以用來監(jiān)測慢性乙肝患者進(jìn)行抗病毒治療后cccDNA的清除情況，從而為評價抗病毒藥物清除病毒的效果提供了重要的技術(shù)平臺。目前，研究者正依然在對該方法進(jìn)一步開發(fā)，將將其作為乙肝病毒分子病理學(xué)檢測方法進(jìn)行推廣，為臨床醫(yī)師綜合評價患者肝臟內(nèi)病毒學(xué)狀態(tài)提供參考。

來源：生物谷

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