神經(jīng)節(jié)苷脂GM1對(duì)阿爾茨海默病的作用機(jī)制

來(lái)源：百濟(jì)藥房藥訊作者：百濟(jì)動(dòng)態(tài) 瀏覽：發(fā)布時(shí)間：2010/6/10 8:52:00

單位：北京醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科北京醫(yī)科大學(xué)精神衛(wèi)生研究所

　　摘　要　目的：研究神經(jīng)節(jié)苷脂GM1對(duì)β淀粉樣蛋白（Aβ）分泌和β淀粉樣蛋白前體（APP）基因轉(zhuǎn)錄水平的影響，探討GM1在阿爾茨海默病Aβ生成過(guò)程中的作用機(jī)制。方法：利用人類APP695基因轉(zhuǎn)染神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株，免疫沉淀Western印跡法檢測(cè)經(jīng)不同濃度GM1處理的細(xì)胞培養(yǎng)液中的Aβ含量，逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法測(cè)定細(xì)胞中APP mRNA水平。結(jié)果：隨GM1濃度增加，細(xì)胞分泌Aβ增加，GM110μmol．L-1組和100μmol．L-1組分別為對(duì)照組的1.33倍（t=1.29，P＞0.05）和3.07倍（t=3.63，P＜0.05）；而APP mRNA水平無(wú)變化，APP特異性片段與內(nèi)參照的比值3個(gè)組無(wú)顯著性差異（F=0.23，P＞0.05）。結(jié)論：GM1不影響APP基因轉(zhuǎn)錄水平，其促進(jìn)細(xì)胞分泌Aβ的作用可能與干擾APP的水解代謝有關(guān)。

　　阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）最主要的病理特征之一是老年斑（senile plaques，SP）形成。β-淀粉樣蛋白（amyloid-β　protein，βA4或Aβ）是SP的核心成份。AD病人腦中SP的數(shù)量與癡呆的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。因此，對(duì)于有關(guān)影響Aβ的生成、降解、聚集等因素的研究成為現(xiàn)今AD研究的熱點(diǎn)之一。Aβ是它的前體蛋白——β-淀粉樣蛋白前體（amyloid β-protein precursor，APP）的代謝產(chǎn)物，因而，影響APP表達(dá)及代謝的因素勢(shì)必在Aβ生成過(guò)程中起重要作用。

　　神經(jīng)節(jié)苷脂（gangliosides）GM1是中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞膜的重要組成部分。對(duì)于GM1與AD的關(guān)系，目前研究存在爭(zhēng)議。一方面，GM1具有促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)的作用，對(duì)損傷后的神經(jīng)組織有營(yíng)養(yǎng)和修復(fù)等功能，臨床上應(yīng)用GM1治療周圍神經(jīng)損傷、脊髓損傷和中風(fēng)等，甚至有學(xué)者將其試用于AD的治療。另一方面，研究發(fā)現(xiàn)，AD病人血中檢出顯著GM1抗體，AD病人腦組織中的質(zhì)膜Aβ可與GM1緊密結(jié)合，膜結(jié)合型的GM1可以促進(jìn)Aβ的纖維化，說(shuō)明GM1有可能參與AD的發(fā)病機(jī)制。近期研究發(fā)現(xiàn)，外源性給予GM1可使人類APP695基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞分泌Aβ增加，細(xì)胞中APP含量增加。本研究即是在此基礎(chǔ)上，利用APP695基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型，探討GM1增加Aβ生成的作用是否與促進(jìn)APP基因表達(dá)有關(guān)。

　　1　材料與方法
　　1．1　細(xì)胞模型與培養(yǎng)
　　人類APP695 cDNA轉(zhuǎn)染人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株（HY-SY5Y，德國(guó)海德堡大學(xué)分子生物學(xué)中心提供）。將細(xì)胞等分于3個(gè)50 ml培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，每瓶加10 ml 培養(yǎng)基（MEM及 F-12各半，加體積分?jǐn)?shù)為10%的滅活胎牛血清，潮霉素B0．4mg．L-1，購(gòu)于Gibco和BM公司），于37℃，5%（體積分?jǐn)?shù)）CO2條件下培養(yǎng)，至細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)密度大于95%。棄培養(yǎng)液，用1×PBS（pH 7．5）洗滌，分別加入不含血清培養(yǎng)基3ml，兩實(shí)驗(yàn)組分別加入10和100μmol．L-1GM1，對(duì)照組細(xì)胞加入等體積PBS（pH 7．5）。細(xì)胞于37℃，5%（體積分?jǐn)?shù)）CO2條件下培養(yǎng)8h。

　　1．2　免疫沉淀及Western印跡檢測(cè)培養(yǎng)基中的Aβ含量
　　分別取各組培養(yǎng)基，2500r．min-1離心20min，取上清。各加入抗Aβ1-16單克隆抗體W0-2（德國(guó)海德堡大學(xué)分子生物學(xué)中心提供）5μg，蛋白質(zhì)G-agarose 25μl（BM公司），于室溫旋轉(zhuǎn)混合4h。離心（2500r．min-1，20min）后棄上清，沉淀物用10mmol．L-1 Tris緩沖液（pH　7．4）洗滌3次，加2×加樣緩沖液各25μl，于95℃變性10min。離心，取上清上樣。采用100g．L-1Tris-Tricine 凝膠電泳，電泳結(jié)束后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（350mA，40min）。NC膜置于PBS（pH7．5）中煮沸5min，室溫下以100g．L－1脫脂奶粉（溶于PBS）封閉1　h，PBS漂洗3次，加入一抗W0-2（體積比1∶2000稀釋于2．5g．L－1牛血清白蛋白的PBS中）室溫下孵育1h。PBS漂洗后加堿性磷酸酶偶聯(lián)抗鼠IgG（體積比1∶2000稀釋于2.5g．L-1牛血清白蛋白的PBS中）室溫孵育1　h，用PBS漂洗后以BCIP/NBT系統(tǒng)染色。

　　1．3　RT-PCR
　　移去培養(yǎng)基的細(xì)胞用PBS洗滌，用RNA提取試劑（Life Technologies公司產(chǎn)品）及其提供的方法提取總RNA，并用該公司推薦方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。

　　PCR APP695片段，上游引物5′-CTG CCC GGT TTG GCA CTG CTC-3′，下游引物5′-CTT GCA CCA GTT CTG GAT G-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度294bp。PCR反應(yīng)條件，95℃3min后；94℃變性30s，60℃退火1min，70℃延伸1.5min；共35個(gè)循環(huán)，最后72℃10min。內(nèi)參照采用3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH），擴(kuò)增片段長(zhǎng)度572bp，擴(kuò)增條件詳見(jiàn)文獻(xiàn)［9］。擴(kuò)增完畢后兩種PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

　　1．4　結(jié)果統(tǒng)計(jì)
　　Western印跡結(jié)果經(jīng)AGFA ARCUS Ⅱ掃描儀讀取，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果經(jīng)Kodak數(shù)字照相機(jī)拍照，采用Kodak Digital Science 1D Image Analysis Software軟件系統(tǒng)定量分析，吸光度數(shù)值用SPSS軟件單因素方差分析及配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

　　2　結(jié)果
　　細(xì)胞培養(yǎng)液中加入GM1后細(xì)胞分泌的Aβ含量增加，5次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)均得到相同結(jié)果（F=9.45， P＜0.01）。經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn)，10μmol．L-1 GM1組細(xì)胞分泌Aβ的含量為對(duì)照組的1.33倍（t=1.29， P＞0.05），而 100μmol．L－1組是對(duì)照組的3.07倍（t=3.63， P＜0.05），證明經(jīng)較高濃度的GM1處理，細(xì)胞分泌的Aβ含量增加具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1）。

　　RT-PCR結(jié)果：APP特異性片段與內(nèi)參照的光密度比值3個(gè)組分別為1.38±0.32，1.35±0.18和1.45±0.16。配對(duì)t檢驗(yàn)結(jié)果，10μmol．L-1組為對(duì)照組的0.97倍（t=0.52，P＞0.05），100μmol．L-1組是對(duì)照組的1.07倍（t= 0.61， P＞0.05）。3組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別（圖2）。

3　討論
　　Aβ由APP一種跨膜糖蛋白水解產(chǎn)生。在Aβ的N末端和C末端分別由β和γ分泌酶水解APP，產(chǎn)生完整的Aβ片段。在正常情況下，這并不是主要的代謝途徑。由α分泌酶切割后產(chǎn)生的含部分Aβ片段的分泌性APP（APPs）和C末端片段是主要的途徑。由于APP基因過(guò)表達(dá)導(dǎo)致APP生成增加，APP基因在α、β和γ分泌酶作用位點(diǎn)附近的突變，某些其他因素促進(jìn)β和γ分泌酶的活性或抑制α分泌酶的活性等都可能使Aβ的生成增加。

　　本研究結(jié)果證實(shí)，外源性GM1，可使細(xì)胞培養(yǎng)基中Aβ含量增多，這與既往文獻(xiàn)結(jié)果類似。既往研究發(fā)現(xiàn)，GM1在促使Aβ釋放的同時(shí)，使細(xì)胞溶解物中的APP含量增加，并減少APPs的生成，從而提出GM1干擾APP水解代謝的假說(shuō)。但是，由于GM1本身能夠參與細(xì)胞代謝，具有促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，因此，不能否認(rèn)GM1可能通過(guò)某些環(huán)節(jié)促進(jìn)APP基因的表達(dá)，使APP產(chǎn)量增加，進(jìn)而增加Aβ的生成。或者GM1同時(shí)影響APP的合成代謝和水解代謝，兩種作用結(jié)合，造成Aβ分泌的增多。本研究即是通過(guò)考察 APP基因的轉(zhuǎn)錄水平來(lái)探討這一可能性是否存在。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，給予不同濃度的GM1處理后，在Aβ的分泌明顯增加的同時(shí)，細(xì)胞的APP mRNA水平并沒(méi)有產(chǎn)生變化。說(shuō)明GM1并不作用于APP基因的轉(zhuǎn)錄水平，APP的合成代謝不受影響。因此支持GM1干擾其分解代謝過(guò)程的假說(shuō)。

　　此外，GM1處理一段時(shí)間后細(xì)胞培養(yǎng)液中的Aβ含量增多。除了細(xì)胞分泌Aβ增多外，尚有可能為培養(yǎng)液中GM1的存在抑制了Aβ的正常降解。研究發(fā)現(xiàn)Aβ可和GM1緊密結(jié)合，此種GM1結(jié)合型的Aβ是否不易被降解有待進(jìn)一步研究。

　　本研究及既往文獻(xiàn)的離體實(shí)驗(yàn)結(jié)果均提示GM1在AD的Aβ生成過(guò)程中起重要作用。推論在AD病人中，GM1本身的代謝可能發(fā)生異常。AD病人血液中GM1抗體的顯著增加，也從另一方面支持這一推論。

　　本研究采用的GM1因其多方面的功能正是目前常用的一種臨床制劑。因此，雖然GM1與AD的因果關(guān)系目前尚無(wú)定論，但其負(fù)面影響不容忽視。臨床醫(yī)生在使用GM1治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病時(shí)需縝密考慮。總之，GM1在AD發(fā)病過(guò)程中所起的作用以及臨床治療的機(jī)制均需更深層次的研究。