羅執(zhí)芬，周云 ，劉明月
河南省人民醫(yī)院腫瘤科鄭州市450003

【摘要】 目的 探討羥基喜樹堿誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期變化的關(guān)系。方法 用MTT法測(cè)定不同濃度的HCPT對(duì)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，用流式細(xì)胞儀測(cè)定一定濃度下不同作用時(shí)間細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期的變化。結(jié)果 在3．125～5O．O g／ml濃度范圍內(nèi)藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率隨濃度的增加而增加；在相同濃度下，隨時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞的凋亡率也逐漸增加，0、12、24、48h的凋亡率為2、8％ 、8．5％ 、10．2％ ，13．3％ ，在24h內(nèi)S期細(xì)胞減少而Gn／G 細(xì)胞增多，第二個(gè)24h S期和G ／M的阻滯。結(jié)論 羥基喜樹堿可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，其細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期分布有關(guān)。

關(guān)鍵詞 羥基喜樹堿；胃癌；細(xì)胞凋亡

    羥基喜樹堿是從我國(guó)特有的珙桐科植物喜樹中提取分離的天然生物堿，是一類廣譜的抗腫瘤藥，尤其在消化道腫瘤中的應(yīng)用更多。近年來不少研究人員對(duì)羥基喜樹堿誘導(dǎo)不同腫瘤細(xì)胞的凋亡進(jìn)行了大量的研究，細(xì)胞周期與凋亡有著密切的關(guān)系，為了探討羥基喜樹堿誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與細(xì)胞周期的關(guān)系，為臨床設(shè)計(jì)更有效的治療方案提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，特設(shè)計(jì)此實(shí)驗(yàn)。

1 材料與方法
1．1 材料 ①細(xì)胞株：人胃癌細(xì)胞BGC一823，河南省醫(yī)學(xué)研究所惠贈(zèng)。② 實(shí)驗(yàn)用藥物及試劑：羥基喜樹堿為湖北黃石飛云藥業(yè)產(chǎn)品；1640培養(yǎng)基為GIBCO公司產(chǎn)品；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTY)為Sigma公司產(chǎn)品；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清為天津TBD血液研究所產(chǎn)品。

1．2 方法 ①M(fèi)rlT法測(cè)定不同濃度羥基喜樹堿對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率。實(shí)驗(yàn)藥物濃度按預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選五個(gè)濃度組即0、3．125、6．250、12．500、25．000、50．O00gg／ml。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞稀釋成4×10 ／ml，接種于96孔板，孵育24 h，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入實(shí)驗(yàn)用藥，設(shè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，放人培養(yǎng)箱中孵育48 h，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在570 am波長(zhǎng)測(cè)每孔的吸光值(A)，按下列公式計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率：細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(％)=(1一實(shí)驗(yàn)組平均A值／對(duì)照組平均A值)×100％。每組重復(fù)5次。②細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期檢測(cè)：本次取6．2501xg／ml組作流式細(xì)胞儀檢測(cè)，取4個(gè)時(shí)間段，即藥物作用后0、12、24、48 h進(jìn)行檢測(cè)。按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)處理細(xì)胞后，用70％ 的冷乙醇固定。采用碘化丙錠(PI)一步插人性DNA定量熒光染色法，檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS10．0統(tǒng)計(jì)軟件包處理。計(jì)量資料采用正態(tài)性檢驗(yàn)，方差齊性檢驗(yàn)，率的比較采用x 檢驗(yàn)，以 =0．05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果
    本實(shí)驗(yàn)中HCPT單藥對(duì)BGC一823細(xì)胞有明顯的抑制生長(zhǎng)的作用(見圖1)，其IC50為27．420~g／ml。相關(guān)性分析結(jié)果相關(guān)系數(shù)r為0．986。在流式細(xì)胞圖上可看到典型的亞二倍體凋亡峰(見圖2)，細(xì)胞周期分布顯示(見表1)，24h內(nèi)S期細(xì)胞隨時(shí)間延長(zhǎng)而減少，G。／G。期細(xì)胞漸增多，凋亡率也增加。與0h相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 討論
    本組實(shí)驗(yàn)表明羥基喜樹堿可以誘導(dǎo)胃癌BGC一823細(xì)胞的凋亡，其凋亡率有時(shí)問依賴性，其與細(xì)胞周期的變化有一定的相關(guān)性。在0h S期細(xì)胞所占的比率較大，加入藥物后的第一個(gè)24h，細(xì)胞中S期細(xì)胞的比率明顯下降，而G 期的細(xì)胞增多。在第二個(gè)24h S期細(xì)胞明顯增多，與0h比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明羥基喜樹堿誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制可能與G．期和S期細(xì)胞的阻滯有關(guān)。許青在胃癌細(xì)胞，肺癌細(xì)胞上研究了羥基喜樹堿誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制，揭示了誘導(dǎo)凋亡是其抗腫瘤作用的主要機(jī)制之一。Chai LP 用低劑量的HCPT作用于喉鱗癌細(xì)胞，表現(xiàn)出G ／M的阻滯，高劑量時(shí)表現(xiàn)出s期細(xì)胞的阻滯。而本試驗(yàn)低劑量時(shí)表現(xiàn)出第一個(gè)24h G。阻滯和第二個(gè)24h的S和G ／M期的阻滯，這一特點(diǎn)與喜樹堿的半合成品伊立替康作用于結(jié)腸癌細(xì)胞HT一29對(duì)細(xì)胞周期的分布影響有相似之處 J。細(xì)胞凋亡存在著周期特異性，表現(xiàn)為不同的因素誘導(dǎo)的凋亡，發(fā)生在細(xì)胞的不同周期時(shí)段。進(jìn)一步地研究HCPT對(duì)細(xì)胞周期的分布特點(diǎn)，將為不同藥物聯(lián)合使用提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

參考文獻(xiàn)（略）

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