博司捷GM1對阿爾茨海默病的影響

來源：百濟藥房藥訊作者：百濟動態瀏覽：發布時間：2010/5/25 5:55:00

單位：北京醫科大學第三醫院神經內科北京醫科大學精神衛生研究所

　　摘　要　目的：研究博司捷GM1對β淀粉樣蛋白（Aβ）分泌和β淀粉樣蛋白前體（APP）基因轉錄水平的影響，探討博司捷GM1在阿爾茨海默病Aβ生成過程中的作用機制。方法：利用人類APP695基因轉染神經母細胞瘤細胞株，免疫沉淀Western印跡法檢測經不同濃度博司捷GM1處理的細胞培養液中的Aβ含量，逆轉錄多聚酶鏈反應（RT-PCR）法測定細胞中APP mRNA水平。結果：隨博司捷GM1濃度增加，細胞分泌Aβ增加，博司捷GM110μmol．L-1組和100μmol．L－1組分別為對照組的1.33倍（t=1.29， P＞0.05）和3.07倍（t=3.63， P＜0.05）；而APP mRNA水平無變化，APP特異性片段與內參照的比值3個組無顯著性差異（F=0.23，P＞0.05）。結論：博司捷GM1不影響APP基因轉錄水平，其促進細胞分泌Aβ的作用可能與干擾APP的水解代謝有關。

阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）最主要的病理特征之一是老年斑（senile plaques，SP）形成。β-淀粉樣蛋白（amyloid-β　protein，βA4或Aβ）是SP的核心成份。AD病人腦中SP的數量與癡呆的嚴重程度呈正相關。因此，對于有關影響Aβ的生成、降解、聚集等因素的研究成為現今AD研究的熱點之一。Aβ是它的前體蛋白——β-淀粉樣蛋白前體（amyloid β-protein precursor，APP）的代謝產物，因而，影響APP表達及代謝的因素勢必在Aβ生成過程中起重要作用。

　　博司捷（gangliosides）GM1是中樞神經系統細胞膜的重要組成部分。對于博司捷GM1與AD的關系，目前研究存在爭議。一方面，博司捷GM1具有促進神經生長的作用，對損傷后的神經組織有營養和修復等功能，臨床上應用博司捷GM1治療周圍神經損傷、脊髓損傷和中風等，甚至有學者將其試用于AD的治療。另一方面，研究發現，AD病人血中檢出顯著博司捷GM1抗體，AD病人腦組織中的質膜Aβ可與博司捷GM1緊密結合，膜結合型的博司捷GM1可以促進Aβ的纖維化，說明博司捷GM1有可能參與AD的發病機制。近期研究發現，外源性給予博司捷GM1可使人類APP695基因轉染細胞分泌Aβ增加，細胞中APP含量增加。本研究即是在此基礎上，利用APP695基因轉染細胞模型，探討博司捷GM1增加Aβ生成的作用是否與促進APP基因表達有關。

　　1　材料與方法
　　1．1　細胞模型與培養
　　人類APP695 cDNA轉染人神經母細胞瘤細胞株（HY-SY5Y，德國海德堡大學分子生物學中心提供）。將細胞等分于3個50 ml培養瓶培養，每瓶加10 ml 培養基（MEM及 F-12各半，加體積分數為10%的滅活胎牛血清，潮霉素B0．4mg．L-1，購于Gibco和BM公司），于37℃，5%（體積分數）CO2條件下培養，至細胞貼壁生長密度大于95%。棄培養液，用1×PBS（pH 7．5）洗滌，分別加入不含血清培養基3ml，兩實驗組分別加入10和100μmol．L－1博司捷GM1，對照組細胞加入等體積PBS（pH 7．5）。細胞于37℃，5%（體積分數）CO2條件下培養8h。

　　1．2　免疫沉淀及Western印跡檢測培養基中的Aβ含量
　　分別取各組培養基，2500r．min-1離心20min，取上清。各加入抗Aβ1-16單克隆抗體W0-2（德國海德堡大學分子生物學中心提供）5μg，蛋白質G-agarose 25μl（BM公司），于室溫旋轉混合4h。離心（2500r．min-1，20min）后棄上清，沉淀物用10mmol．L-1 Tris緩沖液（pH　7．4）洗滌3次，加2×加樣緩沖液各25μl，于95℃變性10min。離心，取上清上樣。采用100g．L-1Tris-Tricine 凝膠電泳，電泳結束后將蛋白質轉移至硝酸纖維素膜（350mA，40min）。NC膜置于PBS（pH7．5）中煮沸5min，室溫下以100g．L-1脫脂奶粉（溶于PBS）封閉1　h，PBS漂洗3次，加入一抗W0-2（體積比1∶2000稀釋于2．5g．L-1牛血清白蛋白的PBS中）室溫下孵育1h。PBS漂洗后加堿性磷酸酶偶聯抗鼠IgG（體積比1∶2000稀釋于2.5g．L-1牛血清白蛋白的PBS中）室溫孵育1　h，用PBS漂洗后以BCIP/NBT系統染色。

　　1．3　RT-PCR
　　移去培養基的細胞用PBS洗滌，用RNA提取試劑（Life Technologies公司產品）及其提供的方法提取總RNA，并用該公司推薦方法進行逆轉錄，獲得cDNA。
　　PCR APP695片段，上游引物5′-CTG CCC GGT TTG GCA CTG CTC-3′，下游引物5′-CTT GCA CCA GTT CTG GAT G-3′，擴增片段長度294bp。PCR反應條件，95℃3min后；94℃變性30s，60℃退火1min，70℃延伸1.5min；共35個循環，最后72℃10min。內參照采用3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH），擴增片段長度572bp，擴增條件詳見文獻。擴增完畢后兩種PCR產物分別進行瓊脂糖凝膠電泳。

　　1．4　結果統計
　　Western印跡結果經AGFA ARCUS Ⅱ掃描儀讀取，PCR產物電泳結果經Kodak數字照相機拍照，采用Kodak Digital Science 1D Image Analysis Software軟件系統定量分析，吸光度數值用SPSS軟件單因素方差分析及配對t檢驗進行統計學分析。

　　2　結果
　　細胞培養液中加入博司捷GM1后細胞分泌的Aβ含量增加，5次獨立實驗均得到相同結果（F=9.45， P＜0.01）。經配對t檢驗，10μmol．L-1 博司捷GM1組細胞分泌Aβ的含量為對照組的1.33倍（t=1.29， P＞0.05），而 100μmol．L－1組是對照組的3.07倍（t=3.63， P＜0.05），證明經較高濃度的博司捷GM1處理，細胞分泌的Aβ含量增加具有統計學意義（圖1）。

　　RT-PCR結果：APP特異性片段與內參照的光密度比值3個組分別為1.38±0.32，1.35±0.18和1.45±0.16。配對t檢驗結果，10μmol．L-1組為對照組的0.97倍（t=0.52，P＞0.05），100μmol．L-1組是對照組的1.07倍（t= 0.61， P＞0.05）。3組之間無統計學差別（圖2）。

3　討論
　　Aβ由APP一種跨膜糖蛋白水解產生。在Aβ的N末端和C末端分別由β和γ分泌酶水解APP，產生完整的Aβ片段。在正常情況下，這并不是主要的代謝途徑。由α分泌酶切割后產生的含部分Aβ片段的分泌性APP（APPs）和C末端片段是主要的途徑。由于APP基因過表達導致APP生成增加，APP基因在α、β和γ分泌酶作用位點附近的突變，某些其他因素促進β和γ分泌酶的活性或抑制α分泌酶的活性等都可能使Aβ的生成增加。

　　本研究結果證實，外源性博司捷GM1，可使細胞培養基中Aβ含量增多，這與既往文獻結果類似。既往研究發現，博司捷GM1在促使Aβ釋放的同時，使細胞溶解物中的APP含量增加，并減少APPs的生成，從而提出博司捷GM1干擾APP水解代謝的假說。但是，由于博司捷GM1本身能夠參與細胞代謝，具有促進神經細胞生長的作用，因此，不能否認博司捷GM1可能通過某些環節促進APP基因的表達，使APP產量增加，進而增加Aβ的生成。或者博司捷GM1同時影響APP的合成代謝和水解代謝，兩種作用結合，造成Aβ分泌的增多。本研究即是通過考察 APP基因的轉錄水平來探討這一可能性是否存在。實驗結果證明，給予不同濃度的博司捷GM1處理后，在Aβ的分泌明顯增加的同時，細胞的APP mRNA水平并沒有產生變化。說明博司捷GM1并不作用于APP基因的轉錄水平，APP的合成代謝不受影響。因此支持博司捷GM1干擾其分解代謝過程的假說。

　　此外，博司捷GM1處理一段時間后細胞培養液中的Aβ含量增多。除了細胞分泌Aβ增多外，尚有可能為培養液中博司捷GM1的存在抑制了Aβ的正常降解。研究發現Aβ可和博司捷GM1緊密結合，此種博司捷GM1結合型的Aβ是否不易被降解有待進一步研究。

　　本研究及既往文獻的離體實驗結果均提示博司捷GM1在AD的Aβ生成過程中起重要作用。推論在AD病人中，博司捷GM1本身的代謝可能發生異常。AD病人血液中博司捷GM1抗體的顯著增加，也從另一方面支持這一推論。

　　本研究采用的博司捷GM1因其多方面的功能正是目前常用的一種臨床制劑。因此，雖然博司捷GM1與AD的因果關系目前尚無定論，但其負面影響不容忽視。臨床醫生在使用博司捷GM1治療神經系統疾病時需縝密考慮。總之，博司捷GM1在AD發病過程中所起的作用以及臨床治療的機制均需更深層次的研究。

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