HPLC法測定和日注射用胸腺肽α1的含量

    注射用胸腺肽α1主要成分為胸腺肽α1，是化學合成的28肽，臨床用于慢性乙型肝炎和作為免疫損害病者的疫苗免疫應答增強劑。在2010年版中國藥典二部中收錄的注射用胸腺肽α1標準［1］和國家食品藥品監督管理局頒布的藥品試行標準（YBH26822005）中規定的含量測定方法，梯度洗脫時間較長，操作繁瑣且重復性較差。本實驗對注射用胸腺肽α1含量測定方法進行了改進，現報道如下。

    1 試藥與儀器

    1.1 試藥

    胸腺肽α1對照品及注射用胸腺肽α1（海南某藥品研發公司提供），對照品含量：99.78%，乙腈為色譜純，磷酸二氫鉀為分析純。

    1.2 儀器

    Agilent 1100 高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；DAD二極管陣列檢測器（美國安捷倫公司）。

    2 實驗方法與結果

    2.1 色譜條件與系統適用性試驗

    色譜柱：Luna C18 ( 5μm ，4.6mm×250mm)；以0.05mol/L磷酸二氫鉀緩沖液(pH5.7)�惨译�(92∶8)為流動相A，乙腈為流動相B，采用梯度洗脫，在8min之內流動相B由3%增加到9%，在2min之內流動相B降為3%，并平衡5min，檢測波長為210nm，進樣量20μL，理論板數按胸腺肽α1峰計算應大于5000。

    2.2 測定方法

    余邦良等.HPLC法測定注射用胸腺肽α1的含量
    取本品適量，用0.05mol/L磷酸二氫鉀緩沖液(pH6.8)溶解，制成1mL中約含胸腺肽α1 0.1mg的溶液，作為供試品溶液（臨用前配制），精密量取20μL，注入液相色譜儀，參照高效液相色譜法［2］，記錄色譜圖；另精密稱取胸腺肽α1對照品適量，用0.05mol/L磷酸二氫鉀緩沖液(pH6.8)溶解，制成1mL中約含胸腺肽α1 0.1mg的溶液，作為對照品溶液（臨用前配制），同法測定，按外標法以峰面積計算，其平均含量應符合規定。

    2.3 輔料干擾試驗

    按處方量精密稱取甘露醇、氫氧化鈉，并另取注射用胸腺肽α1，按“2.2項”制成輔料溶液和供試品溶液，分別取20μL注入液相色譜儀，按含量測定法記錄色譜圖（圖1、2），從圖譜上可以看出, 這些輔料在主峰吸收處均無吸收，故不影響注射用胸腺肽α1含量的測定。

    2.4 回收率試驗

    稱取按處方量計算的輔料9份，分別加入標示量80%、100%、120%的胸腺肽α1，每種標示量各3份樣，分別置相應的量瓶中，按“2.2項”制成供試品溶液，按含量測定方法，記錄色譜圖，計算其回收率。平均回收率為99.4%，RSD為0.25%。

    2.5 精密度試驗

    取同一批號的注射用胸腺肽α1 6瓶，按“2.2項”制成供試品溶液，按含量測定方法，每個供試品溶液平行測定6次，記錄色譜圖，主峰面積的RSD為0.34%。

    2.6 配液穩定性試驗

    取注射用胸腺肽α1適量，按“2.2項”制成供試品溶液，將其放置在20～25℃的室溫下，分別于配樣后第0、2、4、8、12h取樣按含量測定方法分析，主峰面積的RSD為0.54%，結果表明供試品溶液在12h內較穩定。

    2.7 線性試驗

    取注射用胸腺肽α1適量，按“2.2項”制成1mL中約含胸腺肽α1 1mg的溶液，并分別稀釋成含胸腺肽α1 0.8、0.4、0.2、0.1、0.05 mg/L 的溶液，按含量測定方法測定，記錄色譜圖，以進樣濃度X（mg/L ）為橫坐標，胸腺肽α1峰面積積分值Y為縱坐標，繪制標準曲線。計算其線性方程為：Y=18980X+13480433，r=0.9999。線性范圍0.05～0.8mg/L。

    2.8 樣品含量測定

    取注射用胸腺肽α1 8瓶（1.6mg/瓶），各瓶精密加入0.05mol/L磷酸二氫鉀緩沖液(pH6.8)1.6mL溶解，合并，精密吸取5mL置50mL量瓶中，稀釋至刻度，制成1mL中約含胸腺肽α1 0.1mg的溶液，作為供試品溶液（臨用前配制），精密量取20μL，注入液相色譜儀，按高效液相色譜法［2］，記錄色譜圖；另取經五氧化二磷干燥至恒重的胸腺肽α1對照品適量，同法測定，按外標法以峰面積計算其平均含量。3批樣品含量分別為100.9%、100.1%、100.2%。

    3 討論

    原法 “YBH26822005” 的含量測定的梯度洗脫，在20min內流動相B由0增加到9%，然后在1min內流動相B降為0，并用流動相A平衡10min。經試驗發現該法耗時長，且重現性差。本文對其梯度洗脫法進行修改：在8min之內流動相B由3%增加到9%，在2min之內流動相B降為3%，并平衡5min。

    通過方法學研究，發現各項試驗均符合規定，且與原法的含量檢測結果一致，同時克服原法檢測時間長、重現性差的缺點。使用該法測定含量準確、快速、簡便，專屬性提高，有利于更好地控制產品質量，進一步完善產品的質量標準。

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