抗病毒治療后免疫細胞的改變

    【摘要】目的：動態(tài)觀察阿德福韋酯治療HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者外周血HBV特異性T淋巴細胞功能和非特異性免疫細胞的改變，探討其與HBeAg血清學(xué)陰轉(zhuǎn)的相關(guān)性；以進一步探討抗病毒治療的免疫機制。
    方法：20例HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者予以阿德福韋酯治療48周，酶聯(lián)免疫斑點試驗檢測分泌干擾素γ的HBV特異性CD4+T淋巴細胞頻數(shù)，流式細胞術(shù)檢測調(diào)節(jié)性T淋巴細胞（Treg）數(shù)量和自然殺傷細胞活化受體NKG2D的表達。根據(jù)資料不同采用t檢驗或Mann-Whitney U檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析。
    結(jié)果：治療48周時有6例（占30%）患者出現(xiàn)HBeAg的轉(zhuǎn)陰，分為HBeAg陰轉(zhuǎn)組（n=6）和HBeAg未陰轉(zhuǎn)組（n=14）。伴隨病毒載量的下降，HBeAg陰轉(zhuǎn)組治療后HBcAg特異性CD4+T淋巴細胞分泌IFN γ和細胞增殖的能力均較治療前增強，同時也較HBeAg未陰轉(zhuǎn)組增強，48周時（外周血單核細胞中的斑點形成細胞數(shù)）的（661.25±281.97）×10-6對比0周時的（280.75±104.33）×10-6，P=0.045，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；而HBeAg未陰轉(zhuǎn)組治療前后無改變。同時Treg數(shù)量逐漸下降，4周后趨于穩(wěn)態(tài)；而NKG2D在治療后12周開始持續(xù)上升，48周較基線值顯著增加（P=0.000）。Treg和NKG2D的表達趨勢在HBeAg陰轉(zhuǎn)組和未陰轉(zhuǎn)組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
    結(jié)論：阿德福韋酯抗病毒治療過程，伴隨病毒負荷下降，部分患者HBV特異性T淋巴細胞功能呈一過性增強，與HBeAg陰轉(zhuǎn)密切相關(guān)；進一步證實HBV特異性T淋巴細胞功能的恢復(fù)是清除病毒，促進HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的重要因素。 

    慢性HBV感染過程，機體的免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)錯綜復(fù)雜，包括T淋巴細胞（簡稱T細胞）、自然殺傷（NK）細胞以及調(diào)節(jié)性T細胞（regulate T cell，Treg）、樹突狀細胞等免疫細胞密切相關(guān)、相互調(diào)節(jié)。研究證實HBV特異性T細胞和NK細胞作為抗病毒的重要免疫細胞在急性乙型肝炎患者清除病毒，實現(xiàn)持久免疫控制中起重要作用。但對其在慢性乙型肝炎發(fā)病過程中的作用所知甚少；而調(diào)節(jié)性T細胞具有負相調(diào)節(jié)T細胞和NK細胞等免疫細胞的功能。在慢性HBV感染免疫耐受形成中起作用。近年的研究結(jié)果顯示，核苷（酸）類似物抑制病毒復(fù)制控制HBV感染的過程，有部分患者可以實現(xiàn)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換，達到持久免疫控制；如何解釋相同的藥物卻有不同的臨床結(jié)局，實現(xiàn)免疫控制的這部分患者，其宿主免疫細胞功能的作用機制并不明確。 
    本研究通過動態(tài)觀察阿德福韋酯治療HBeAg陽性的慢性乙型肝炎患者，伴隨病毒下降的過程，外周血特異性（HBV特異性CD4+T細胞功能）和非特異性免疫細胞[Treg及MK細胞活化受體（NKG2D）表達]的改變，與HBeAg血清學(xué)應(yīng)答的相關(guān)性。進一步探討病毒負荷下降對宿主免疫功能的影響，對深入研究治療應(yīng)答的免疫學(xué)機制，持久免疫控制HBV具有重要的臨床意義。 

    資料與方法 
    1.研究對象和治療方法：研究入選符合2005年中華醫(yī)學(xué)會感染病學(xué)分會及肝病學(xué)分會聯(lián)合制訂的《慢性乙型肝炎防治指南》診斷標(biāo)準(zhǔn)的HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者50例。均為初治患者，近半年內(nèi)未服用任何抗病毒和免疫調(diào)節(jié)藥物。排除合并其他肝炎病毒感染，如HAV、HCV等；其他肝病，如酒精性肝病、自身免疫性肝病、藥物及中毒性肝病；所有患者均接受阿德福韋酯10 mg/d治療，隨訪研究48周。在治療前、治療后4周、12周、24周、36周、48周及出現(xiàn)HBeAg消失時留取血樣（肝素鈉抗凝全血）作為隨訪檢測標(biāo)本，分離外周血單核細胞凍存，分批進行以下的檢測。HBsAg陰性的健康對照者8例為對照組。入選患者均簽署知情同意書，研究方案通過福建醫(yī)科大學(xué)倫理委員會審查。 
    2.HBV特異性T細胞功能檢測：（1）FICOLL-HYPAQUE（聚蔗糖-泛影葡胺，F(xiàn)-H）密度離心法分離外周血單個核細胞（PBMC）：無菌采集抗凝外周血15 ml，磷酸鹽緩沖溶液（PBS）等體積稀釋后，吸取細胞稀釋懸液緩慢加至等體積的淋巴細胞分離液上，室溫下450×g離心20 min。分離得到的PBMC，PBS液洗滌2次；最后用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液重懸，用2%錐蟲藍染液檢測細胞活性，活細胞在95%以上。部分細胞凍存?zhèn)溆谩＃?）細胞凍存和復(fù)蘇。（3）BrdU標(biāo)記法測定T細胞增殖：按BrdU淋巴細胞增殖試驗試劑盒說明書操作，步驟如下：實驗設(shè)為陽性對照植物血凝素組（PHA 10 μg/ml）、實驗組分別為HBcAg組（2 μg/ml），陰性對照組，空白對照組；每組設(shè)三個復(fù)孔，將新鮮分離的PBMC以2×105個/孔接種在96孔細胞培養(yǎng)板上，同時加入刺激的抗原，37℃培養(yǎng)箱孵育48 h。加入BrdU labeling solution標(biāo)記孵育22 h。洗板、顯色，以DU800分光光度儀分析，結(jié)果以490 nm波長測量的吸光度（A值）表示。SI值：（實驗組-空白組）/（陰性對照組-空白組）。（4）酶聯(lián)免疫斑點試驗（ELISPOT）檢測分泌IFN γ的HBV特異性CD4+T淋巴細胞頻數(shù)：實驗設(shè)為陽性對照組（PHA 10 μg/ml），實驗組（HBcAg 2 μg/ml），陰性對照組及空白對照組，每組設(shè)3個復(fù)孔。PBMC均為隨訪治療過程凍存后復(fù)蘇的細胞。具體操作見試劑盒說明書，以稀釋后的抗IFN γ抗體（購自美國BD Pharmingen公司）包被底部為聚偏氟乙烯的96孔培養(yǎng)板，4℃過夜。次日洗板、封閉；加入所配刺激原和復(fù)蘇后的PBMC 2×105個/孔；終體積為200 μl/孔。經(jīng)孵育、洗板、標(biāo)記、顯色等，采用美國CTL公司Immunospot Analyzer Series3分析儀上讀取孔內(nèi)斑點數(shù)。每一個斑點代表一個分泌IFN γ的細胞，計數(shù)斑點形成細胞（SFC）數(shù)，記錄數(shù)據(jù)為實驗孔測得值-陰性對照孔測得值，以SFC除以106個PBMC為單位計算。 
    3.檢測外周血Treg細胞和NK細胞表面受體NKG2D的表達：取肝素鈉抗凝全血2管，分別加入CD4- FITC、CD25- PerCP Cy5.5、CD127-PE抗體（購自美國BD Pharmingen公司），另一管加入CD3- FTIC-CD16+CD65- PE、NKG2D- APC抗體（購自美國BD Pharmingen公司）；混勻后室溫避光孵育30 min，加入紅細胞裂解液20 ml，避光孵育15 min后，PBS 2ml洗2編，最后用10 g/L多聚甲醛300 μl重懸固定。使用FACS Calibur儀器（購自美國BD公司）進行流式細胞檢測，收集細胞數(shù)（1~1.5）×105個，用美國BD公司的Cell Quest軟件進行分析。分別分析CD4+CD127lowCD25highTreg占CD4+T細胞的比例，CD3-CD16+CD56+NKG2D+細胞占外周血PBMC的比例，同時每份標(biāo)本均設(shè)自身同型對照。 
    4.統(tǒng)計學(xué)方法：使用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理。計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x(-)±s）表示，連續(xù)變量檢測前進行正態(tài)性檢驗，正態(tài)分布資料采用獨立樣本t檢驗，非正態(tài)分布用Mann-Whitney U檢驗比較組間差異，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 

    結(jié)果 
    1.臨床資料：20例HBeAg陽性的CHB患者，其中男性16例，女性4例。年齡20~41歲，平均（26.7±8.3）歲。HBV DNA（6.71±0.81）log10拷貝/ml，ALT（165±49）U/L、AST （115±63）U/L。阿德福韋酯治療48周后，CHB患者血清HBV DNA下降了2~5 log10拷貝/ml；20例CHB患者有17例血清HBV DNA低于檢測值下限（HBV DNA＜1.0×103 拷貝/ml），其余3例患者血清HBV DNA檢測仍陽性。治療12周時血清ALT、AST水平明顯下降，大部分恢復(fù)正常（85%，17/20），治療至48周時全部正常。20例CHB患者有6例（占30%）出現(xiàn)HBeAg陰轉(zhuǎn)，其中3例（占15%）出現(xiàn)-HBe，實現(xiàn)血清學(xué)轉(zhuǎn)換。無一例耐藥、失訪。根據(jù)治療48周后HBeAg陰轉(zhuǎn)的發(fā)生，將患者分為兩組：分別為HBeAg陰轉(zhuǎn)組（組1，n=6），HBeAg未陰轉(zhuǎn)組（組2，n=14）。比較兩組患者在年齡、性別、治療前HBsAg、HBV NDA及ALT、AST水平間的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。兩組在治療前后病毒學(xué)和生物化學(xué)指標(biāo)見表1。HBsAg陰性健康對照組8例（男性5例，女性3例），年齡20~30歲。 

    2.HBV DNA載量下降后外周血HBcAg特異性CD4+T細胞的功能：（1）比較阿德福韋酯治療前后一年的各隨訪點，可見隨著HBV DNA的下降，HBeAg陰轉(zhuǎn)組分泌IFN γ的HBV特異性CD4+T細胞的頻數(shù)呈逐漸增加的趨勢，12周時達到第一個高峰，與治療前比較[12周時為（629.75±166.99）×10-6對比0周時的（280.75±140.33）×10-6，P=0.012]，至36周和48周時（即出現(xiàn)HBeAg陰轉(zhuǎn)和轉(zhuǎn)換時），分泌IFN γ的細胞頻數(shù)再次顯著升高，與治療前比較[36周時的（783.75±305.49）×10-6對比0周時的（280.75±140.33）×10-6，P=0.021和48周時的（661.25±281.97）×10-6對比0周時的（280.75±140.33）×10-6，P=0.045]；而HBeAg未陰轉(zhuǎn)組表現(xiàn)為治療早期（12周）的輕微增加，與治療前差異無統(tǒng)計學(xué)意義。HBeAg陰轉(zhuǎn)組IFN γ的CD4+T細胞頻數(shù)在治療前后（各時間隨訪點）均高于HBeAg未陰轉(zhuǎn)組，尤其在治療前、治療后12周、24周、36周、48周顯著增加，兩組間差異有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05（圖1）。（2）外周血HBcAg特異性T細胞的增殖功能：HBeAg陰轉(zhuǎn)組HBcAg特異性T細胞增殖能力在治療24周時一過性增高，與基線差異有統(tǒng)計學(xué)意義（24周SI值為2.19±0.58對比0周的1.40±0.39，P=0.038）；而未陰轉(zhuǎn)組治療前后差異無統(tǒng)計學(xué)意義，P值均＞0.05。兩組間比較，24周時HBeAg陰轉(zhuǎn)組的T性別增殖能力較未陰轉(zhuǎn)組增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（HBeAg陰轉(zhuǎn)組SI值為2.19±0.58對比未陰轉(zhuǎn)組的1.48±0.63，P=0.035）同步比較，陽性對照組PHA刺激PBMC后的細胞增殖能力在HBeAg陰轉(zhuǎn)組和未陰轉(zhuǎn)組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，P＞0.05。各組治療前后的細胞增殖能力差異無統(tǒng)計學(xué)意義，P值均＞0.05。 

    3.外周血Treg的表達：隨HBV DNA的下降，Treg也逐漸下降；在病毒下降的快速期（0~4周），Treg明顯下降（0周的10.78%±2.15%對比4周的8.86%±2.30%，P=0.037），縱向分析可見治療4周以后進入了相對平臺期，比較4周、12周、24周及48周各時間點Treg的表達，各時間點的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。HBeAg陰轉(zhuǎn)組和HBeAg未陰轉(zhuǎn)組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，P值均＞0.05。隨HBV DNA的下降，Treg也逐漸下降，兩者之間呈正相關(guān)性趨勢（r=0.808，P=0.000），見圖2、3。 

    4.外周血NK細胞活化受體NKG2D的表達：以CD3-CD16+CD56+NKG2D+代表NK細胞NKG2D的表達（圖4），CHB患者NK細胞表面NKG2D的表達顯著低于健康對照組（3.95%±1.15%對比18.62%±5.36%，P=0.005）。ADV治療后0~12周升高差異有統(tǒng)計學(xué)意義（12周的8.12%±4.74%對比0周的3.95%±1.15%，P=0.008；12周后各時間點NKG2D的表達較治療前升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.02）；至48周達到峰值，較基線值約升高了5倍（48周時的17.52%±6.81%對比0周時的3.95%±1.15%，P=0.000，圖5）。HBeAg陰轉(zhuǎn)組和HBeAg未陰轉(zhuǎn)組NK細胞NKG2D的表達在各個時間點的變化趨勢一致，2組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。NKG2D的表達和HBV DNA間呈負相關(guān)（r=-0.734，P=0.000，圖5）。 

   5.抗病毒治療過程中，NKG2D與Treg動態(tài)變化的相關(guān)性結(jié)果顯示二者呈相反的變化趨勢，但相關(guān)性分析顯示二者間無相關(guān)性。 

   討論 
   研究發(fā)現(xiàn)抗病毒治療的過程，伴隨有部分免疫細胞功能的恢復(fù)，免疫細胞間通過相互調(diào)節(jié)改善免疫微環(huán)境，影響抗病毒的臨床結(jié)局。目前對宿主細胞免疫的抗病毒作用機制的認識非常有限。 
   縱向地觀察阿德福韋酯治療48周，伴隨HBV DNA的下降，HBeAg陰轉(zhuǎn)的患者出現(xiàn)HBV特異性T細胞免疫功能的恢復(fù)；表現(xiàn)為HBeAg陰轉(zhuǎn)組在抗病毒治療后HBV特異性T細胞分泌細胞因子IFN γ和細胞增殖功能較治療前顯著增強，同時也較HBeAg未陰轉(zhuǎn)組顯著增強。由此可見顯著的免疫功能的恢復(fù)主要見于HBeAg陰轉(zhuǎn)的患者，已有的研究結(jié)果顯示病毒負荷的下降促使部分患者HBV特異性T細胞功能恢復(fù)；因此推測，治療后部分特異性細胞免疫功能的恢復(fù)通過非細胞毒途徑如分泌IFN γ進一步清除病毒，實現(xiàn)HBeAg陰轉(zhuǎn)。未實現(xiàn)HBeAg陰轉(zhuǎn)的這一組患者，沒有出現(xiàn)類似的T細胞免疫功能的恢復(fù)，T細胞應(yīng)答仍然低下，病毒載量和HBeAg表達均未陰轉(zhuǎn)。 
   細胞免疫調(diào)節(jié)的網(wǎng)絡(luò)中，特異性T細胞的功能受到多種免疫細胞和免疫因子的調(diào)控，如Treg細胞、NK細胞及PD-1等。本研究中我們發(fā)現(xiàn)阿德福韋酯治療后，HBV DNA快速下降期（0~4周），外周血Treg的比例也顯著下降，二者間呈正相關(guān)，同時，抗病毒的HBV特異性T細胞功能逐漸恢復(fù)，這與Stoop等的研究是一致的，提示病毒負荷下降后，Treg細胞的減少，抑制作用下調(diào)，有利于特異性細胞免疫應(yīng)答的恢復(fù)來清除病毒。進入HBV DNA的緩慢下降期后，Terg數(shù)量沒有繼續(xù)下降，而是進入了相對平衡期；這可能是宿主自身免疫調(diào)節(jié)作用，到一定程度時避免Treg過度調(diào)節(jié)導(dǎo)致自身免疫病理的發(fā)生。這種情況類似于急性肝炎發(fā)病初期較低的Treg數(shù)量有利于特異性細胞免疫反應(yīng)對病毒的清除，而恢復(fù)期Treg數(shù)量的增加則有利于抑制炎癥反應(yīng)對感染組織的損傷。Treg細胞的改變在HBeAg陰轉(zhuǎn)組和未陰轉(zhuǎn)組間無差異，因此，Treg調(diào)節(jié)T細胞的功能，僅是免疫調(diào)節(jié)的一部分，并不能在免疫清除中起絕對作用。 
   NKG2D是NK細胞的活化受體，它的表達與NK細胞活化功能緊密相關(guān)。NK細胞通過活化受體與病毒感染細胞表面配體特異性識別誘導(dǎo)感染細胞死亡；在病毒感染早期清除病毒及免疫誘導(dǎo)T細胞成熟方面有著重要作用。本研究中慢性乙型肝炎患者NK細胞NKG2D的表達較健康人低，NKG2D在CHB患者的低表達，反映了NK細胞的部分活化能力處于抑制狀態(tài)，CHB患者天然免疫NK細胞功能不全。已有研究提示慢性乙型肝炎患者NK細胞功能不全，不足以清除病毒，卻與肝細胞的損傷直接相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，抗病毒治療后，隨著HBV DNA和HBeAg水平的下降，NKG2D的表達逐漸增高，并在48周時達到最高峰。HBV DNA下降與NKG2D表達上調(diào)間形成負性相關(guān)。由此可見，慢性HBV感染的高病毒負荷對NK細胞的活化有抑制作用，降低病毒負荷后，外周血NK細胞活性增強。 
   本研究中，同步觀察抗病毒治療HBV DNA下降的過程，外周血Treg細胞比例下降，并出現(xiàn)NK細胞NKG2D的表達上調(diào)和部分HBV 特異性CD4+T細胞功能的恢復(fù)，NK細胞、T細胞與Treg間的動態(tài)變化呈負相關(guān)。已有研究結(jié)果提示，Treg通過TGF-β的途徑，抑制NK細胞的功能，Treg細胞可下調(diào)NK細胞上NKG2D的表達。據(jù)此推測，病毒被抑制，Treg頻數(shù)下降有利于T細胞功能的恢復(fù)，同樣有利于NK細胞活性的恢復(fù)。NK細胞功能的恢復(fù)，是病毒載量下降直接影響，還是Treg下降后對NK細胞的抑制減弱，從而促進其功能恢復(fù)，還需進一步的研究。
本研究結(jié)果顯示非特異性免疫（Treg和NK）細胞的改變與HBeAg血清學(xué)陰轉(zhuǎn)無明顯相關(guān)性，非特異性免疫僅是改變了機體的免疫環(huán)境，促進了特異性免疫應(yīng)答的恢復(fù)，并不直接影響HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換。而HBV特異性T細胞功能的恢復(fù)與HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換密切相關(guān)，進一步證實決定HBV感染轉(zhuǎn)歸的主要因素是HBV特異性T細胞免疫應(yīng)答的強弱。 

   以上來源：鄭琦，朱月永，陳靖，劉豫瑞，游佳，曾達武，林蘇，江家驥。《抗病毒治療后慢性乙型肝炎患者外周血免疫細胞的改變與HBeAg血清學(xué)陰轉(zhuǎn)的關(guān)系》。《中華肝臟病雜志》。2012年11月第20卷第11期

TAG：乙型肝炎 T淋巴細胞 調(diào)節(jié)性T細胞