【摘要】目的：動態觀察阿德福韋酯治療HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者外周血HBV特異性T淋巴細胞功能和非特異性免疫細胞的改變，探討其與HBeAg血清學陰轉的相關性；以進一步探討抗病毒治療的免疫機制。
    方法：20例HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者予以阿德福韋酯治療48周，酶聯免疫斑點試驗檢測分泌干擾素γ的HBV特異性CD4+T淋巴細胞頻數，流式細胞術檢測調節性T淋巴細胞（Treg）數量和自然殺傷細胞活化受體NKG2D的表達。根據資料不同采用t檢驗或Mann-Whitney U檢驗進行統計學分析。
    結果：治療48周時有6例（占30%）患者出現HBeAg的轉陰，分為HBeAg陰轉組（n=6）和HBeAg未陰轉組（n=14）。伴隨病毒載量的下降，HBeAg陰轉組治療后HBcAg特異性CD4+T淋巴細胞分泌IFN γ和細胞增殖的能力均較治療前增強，同時也較HBeAg未陰轉組增強，48周時（外周血單核細胞中的斑點形成細胞數）的（661.25±281.97）×10-6對比0周時的（280.75±104.33）×10-6，P=0.045，差異有統計學意義；而HBeAg未陰轉組治療前后無改變。同時Treg數量逐漸下降，4周后趨于穩態；而NKG2D在治療后12周開始持續上升，48周較基線值顯著增加（P=0.000）。Treg和NKG2D的表達趨勢在HBeAg陰轉組和未陰轉組間差異無統計學意義。
    結論：阿德福韋酯抗病毒治療過程，伴隨病毒負荷下降，部分患者HBV特異性T淋巴細胞功能呈一過性增強，與HBeAg陰轉密切相關；進一步證實HBV特異性T淋巴細胞功能的恢復是清除病毒，促進HBeAg血清學轉換的重要因素。 

    慢性HBV感染過程，機體的免疫調節系統錯綜復雜，包括T淋巴細胞（簡稱T細胞）、自然殺傷（NK）細胞以及調節性T細胞（regulate T cell，Treg）、樹突狀細胞等免疫細胞密切相關、相互調節。研究證實HBV特異性T細胞和NK細胞作為抗病毒的重要免疫細胞在急性乙型肝炎患者清除病毒，實現持久免疫控制中起重要作用。但對其在慢性乙型肝炎發病過程中的作用所知甚少；而調節性T細胞具有負相調節T細胞和NK細胞等免疫細胞的功能。在慢性HBV感染免疫耐受形成中起作用。近年的研究結果顯示，核苷（酸）類似物抑制病毒復制控制HBV感染的過程，有部分患者可以實現HBeAg血清學轉換，達到持久免疫控制；如何解釋相同的藥物卻有不同的臨床結局，實現免疫控制的這部分患者，其宿主免疫細胞功能的作用機制并不明確。 
    本研究通過動態觀察阿德福韋酯治療HBeAg陽性的慢性乙型肝炎患者，伴隨病毒下降的過程，外周血特異性（HBV特異性CD4+T細胞功能）和非特異性免疫細胞[Treg及MK細胞活化受體（NKG2D）表達]的改變，與HBeAg血清學應答的相關性。進一步探討病毒負荷下降對宿主免疫功能的影響，對深入研究治療應答的免疫學機制，持久免疫控制HBV具有重要的臨床意義。 

    資料與方法 
    1.研究對象和治療方法：研究入選符合2005年中華醫學會感染病學分會及肝病學分會聯合制訂的《慢性乙型肝炎防治指南》診斷標準的HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者50例。均為初治患者，近半年內未服用任何抗病毒和免疫調節藥物。排除合并其他肝炎病毒感染，如HAV、HCV等；其他肝病，如酒精性肝病、自身免疫性肝病、藥物及中毒性肝病；所有患者均接受阿德福韋酯10 mg/d治療，隨訪研究48周。在治療前、治療后4周、12周、24周、36周、48周及出現HBeAg消失時留取血樣（肝素鈉抗凝全血）作為隨訪檢測標本，分離外周血單核細胞凍存，分批進行以下的檢測。HBsAg陰性的健康對照者8例為對照組。入選患者均簽署知情同意書，研究方案通過福建醫科大學倫理委員會審查。 
    2.HBV特異性T細胞功能檢測：（1）FICOLL-HYPAQUE（聚蔗糖-泛影葡胺，F-H）密度離心法分離外周血單個核細胞（PBMC）：無菌采集抗凝外周血15 ml，磷酸鹽緩沖溶液（PBS）等體積稀釋后，吸取細胞稀釋懸液緩慢加至等體積的淋巴細胞分離液上，室溫下450×g離心20 min。分離得到的PBMC，PBS液洗滌2次；最后用含10%胎牛血清的1640培養液重懸，用2%錐蟲藍染液檢測細胞活性，活細胞在95%以上。部分細胞凍存備用。（2）細胞凍存和復蘇。（3）BrdU標記法測定T細胞增殖：按BrdU淋巴細胞增殖試驗試劑盒說明書操作，步驟如下：實驗設為陽性對照植物血凝素組（PHA 10 μg/ml）、實驗組分別為HBcAg組（2 μg/ml），陰性對照組，空白對照組；每組設三個復孔，將新鮮分離的PBMC以2×105個/孔接種在96孔細胞培養板上，同時加入刺激的抗原，37℃培養箱孵育48 h。加入BrdU labeling solution標記孵育22 h。洗板、顯色，以DU800分光光度儀分析，結果以490 nm波長測量的吸光度（A值）表示。SI值：（實驗組-空白組）/（陰性對照組-空白組）。（4）酶聯免疫斑點試驗（ELISPOT）檢測分泌IFN γ的HBV特異性CD4+T淋巴細胞頻數：實驗設為陽性對照組（PHA 10 μg/ml），實驗組（HBcAg 2 μg/ml），陰性對照組及空白對照組，每組設3個復孔。PBMC均為隨訪治療過程凍存后復蘇的細胞。具體操作見試劑盒說明書，以稀釋后的抗IFN γ抗體（購自美國BD Pharmingen公司）包被底部為聚偏氟乙烯的96孔培養板，4℃過夜。次日洗板、封閉；加入所配刺激原和復蘇后的PBMC 2×105個/孔；終體積為200 μl/孔。經孵育、洗板、標記、顯色等，采用美國CTL公司Immunospot Analyzer Series3分析儀上讀取孔內斑點數。每一個斑點代表一個分泌IFN γ的細胞，計數斑點形成細胞（SFC）數，記錄數據為實驗孔測得值-陰性對照孔測得值，以SFC除以106個PBMC為單位計算。 
    3.檢測外周血Treg細胞和NK細胞表面受體NKG2D的表達：取肝素鈉抗凝全血2管，分別加入CD4- FITC、CD25- PerCP Cy5.5、CD127-PE抗體（購自美國BD Pharmingen公司），另一管加入CD3- FTIC-CD16+CD65- PE、NKG2D- APC抗體（購自美國BD Pharmingen公司）；混勻后室溫避光孵育30 min，加入紅細胞裂解液20 ml，避光孵育15 min后，PBS 2ml洗2編，最后用10 g/L多聚甲醛300 μl重懸固定。使用FACS Calibur儀器（購自美國BD公司）進行流式細胞檢測，收集細胞數（1~1.5）×105個，用美國BD公司的Cell Quest軟件進行分析。分別分析CD4+CD127lowCD25highTreg占CD4+T細胞的比例，CD3-CD16+CD56+NKG2D+細胞占外周血PBMC的比例，同時每份標本均設自身同型對照。 
    4.統計學方法：使用SPSS 13.0軟件對數據統計處理。計量資料數據用均數±標準差（x(-)±s）表示，連續變量檢測前進行正態性檢驗，正態分布資料采用獨立樣本t檢驗，非正態分布用Mann-Whitney U檢驗比較組間差異，相關性分析采用Pearson相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。 

    結果 
    1.臨床資料：20例HBeAg陽性的CHB患者，其中男性16例，女性4例。年齡20~41歲，平均（26.7±8.3）歲。HBV DNA（6.71±0.81）log10拷貝/ml，ALT（165±49）U/L、AST （115±63）U/L。阿德福韋酯治療48周后，CHB患者血清HBV DNA下降了2~5 log10拷貝/ml；20例CHB患者有17例血清HBV DNA低于檢測值下限（HBV DNA＜1.0×103 拷貝/ml），其余3例患者血清HBV DNA檢測仍陽性。治療12周時血清ALT、AST水平明顯下降，大部分恢復正常（85%，17/20），治療至48周時全部正常。20例CHB患者有6例（占30%）出現HBeAg陰轉，其中3例（占15%）出現-HBe，實現血清學轉換。無一例耐藥、失訪。根據治療48周后HBeAg陰轉的發生，將患者分為兩組：分別為HBeAg陰轉組（組1，n=6），HBeAg未陰轉組（組2，n=14）。比較兩組患者在年齡、性別、治療前HBsAg、HBV NDA及ALT、AST水平間的差異沒有統計學意義。兩組在治療前后病毒學和生物化學指標見表1。HBsAg陰性健康對照組8例（男性5例，女性3例），年齡20~30歲。 

    2.HBV DNA載量下降后外周血HBcAg特異性CD4+T細胞的功能：（1）比較阿德福韋酯治療前后一年的各隨訪點，可見隨著HBV DNA的下降，HBeAg陰轉組分泌IFN γ的HBV特異性CD4+T細胞的頻數呈逐漸增加的趨勢，12周時達到第一個高峰，與治療前比較[12周時為（629.75±166.99）×10-6對比0周時的（280.75±140.33）×10-6，P=0.012]，至36周和48周時（即出現HBeAg陰轉和轉換時），分泌IFN γ的細胞頻數再次顯著升高，與治療前比較[36周時的（783.75±305.49）×10-6對比0周時的（280.75±140.33）×10-6，P=0.021和48周時的（661.25±281.97）×10-6對比0周時的（280.75±140.33）×10-6，P=0.045]；而HBeAg未陰轉組表現為治療早期（12周）的輕微增加，與治療前差異無統計學意義。HBeAg陰轉組IFN γ的CD4+T細胞頻數在治療前后（各時間隨訪點）均高于HBeAg未陰轉組，尤其在治療前、治療后12周、24周、36周、48周顯著增加，兩組間差異有顯著的統計學意義，P＜0.05（圖1）。（2）外周血HBcAg特異性T細胞的增殖功能：HBeAg陰轉組HBcAg特異性T細胞增殖能力在治療24周時一過性增高，與基線差異有統計學意義（24周SI值為2.19±0.58對比0周的1.40±0.39，P=0.038）；而未陰轉組治療前后差異無統計學意義，P值均＞0.05。兩組間比較，24周時HBeAg陰轉組的T性別增殖能力較未陰轉組增高，差異有統計學意義（HBeAg陰轉組SI值為2.19±0.58對比未陰轉組的1.48±0.63，P=0.035）同步比較，陽性對照組PHA刺激PBMC后的細胞增殖能力在HBeAg陰轉組和未陰轉組間差異無統計學意義，P＞0.05。各組治療前后的細胞增殖能力差異無統計學意義，P值均＞0.05。 

    3.外周血Treg的表達：隨HBV DNA的下降，Treg也逐漸下降；在病毒下降的快速期（0~4周），Treg明顯下降（0周的10.78%±2.15%對比4周的8.86%±2.30%，P=0.037），縱向分析可見治療4周以后進入了相對平臺期，比較4周、12周、24周及48周各時間點Treg的表達，各時間點的差異無統計學意義。HBeAg陰轉組和HBeAg未陰轉組間差異無統計學意義，P值均＞0.05。隨HBV DNA的下降，Treg也逐漸下降，兩者之間呈正相關性趨勢（r=0.808，P=0.000），見圖2、3。 

    4.外周血NK細胞活化受體NKG2D的表達：以CD3-CD16+CD56+NKG2D+代表NK細胞NKG2D的表達（圖4），CHB患者NK細胞表面NKG2D的表達顯著低于健康對照組（3.95%±1.15%對比18.62%±5.36%，P=0.005）。ADV治療后0~12周升高差異有統計學意義（12周的8.12%±4.74%對比0周的3.95%±1.15%，P=0.008；12周后各時間點NKG2D的表達較治療前升高，差異有統計學意義（P=0.02）；至48周達到峰值，較基線值約升高了5倍（48周時的17.52%±6.81%對比0周時的3.95%±1.15%，P=0.000，圖5）。HBeAg陰轉組和HBeAg未陰轉組NK細胞NKG2D的表達在各個時間點的變化趨勢一致，2組間差異無統計學意義。NKG2D的表達和HBV DNA間呈負相關（r=-0.734，P=0.000，圖5）。 

   5.抗病毒治療過程中，NKG2D與Treg動態變化的相關性結果顯示二者呈相反的變化趨勢，但相關性分析顯示二者間無相關性。 

   討論 
   研究發現抗病毒治療的過程，伴隨有部分免疫細胞功能的恢復，免疫細胞間通過相互調節改善免疫微環境，影響抗病毒的臨床結局。目前對宿主細胞免疫的抗病毒作用機制的認識非常有限。 
   縱向地觀察阿德福韋酯治療48周，伴隨HBV DNA的下降，HBeAg陰轉的患者出現HBV特異性T細胞免疫功能的恢復；表現為HBeAg陰轉組在抗病毒治療后HBV特異性T細胞分泌細胞因子IFN γ和細胞增殖功能較治療前顯著增強，同時也較HBeAg未陰轉組顯著增強。由此可見顯著的免疫功能的恢復主要見于HBeAg陰轉的患者，已有的研究結果顯示病毒負荷的下降促使部分患者HBV特異性T細胞功能恢復；因此推測，治療后部分特異性細胞免疫功能的恢復通過非細胞毒途徑如分泌IFN γ進一步清除病毒，實現HBeAg陰轉。未實現HBeAg陰轉的這一組患者，沒有出現類似的T細胞免疫功能的恢復，T細胞應答仍然低下，病毒載量和HBeAg表達均未陰轉。 
   細胞免疫調節的網絡中，特異性T細胞的功能受到多種免疫細胞和免疫因子的調控，如Treg細胞、NK細胞及PD-1等。本研究中我們發現阿德福韋酯治療后，HBV DNA快速下降期（0~4周），外周血Treg的比例也顯著下降，二者間呈正相關，同時，抗病毒的HBV特異性T細胞功能逐漸恢復，這與Stoop等的研究是一致的，提示病毒負荷下降后，Treg細胞的減少，抑制作用下調，有利于特異性細胞免疫應答的恢復來清除病毒。進入HBV DNA的緩慢下降期后，Terg數量沒有繼續下降，而是進入了相對平衡期；這可能是宿主自身免疫調節作用，到一定程度時避免Treg過度調節導致自身免疫病理的發生。這種情況類似于急性肝炎發病初期較低的Treg數量有利于特異性細胞免疫反應對病毒的清除，而恢復期Treg數量的增加則有利于抑制炎癥反應對感染組織的損傷。Treg細胞的改變在HBeAg陰轉組和未陰轉組間無差異，因此，Treg調節T細胞的功能，僅是免疫調節的一部分，并不能在免疫清除中起絕對作用。 
   NKG2D是NK細胞的活化受體，它的表達與NK細胞活化功能緊密相關。NK細胞通過活化受體與病毒感染細胞表面配體特異性識別誘導感染細胞死亡；在病毒感染早期清除病毒及免疫誘導T細胞成熟方面有著重要作用。本研究中慢性乙型肝炎患者NK細胞NKG2D的表達較健康人低，NKG2D在CHB患者的低表達，反映了NK細胞的部分活化能力處于抑制狀態，CHB患者天然免疫NK細胞功能不全。已有研究提示慢性乙型肝炎患者NK細胞功能不全，不足以清除病毒，卻與肝細胞的損傷直接相關。本研究結果顯示，抗病毒治療后，隨著HBV DNA和HBeAg水平的下降，NKG2D的表達逐漸增高，并在48周時達到最高峰。HBV DNA下降與NKG2D表達上調間形成負性相關。由此可見，慢性HBV感染的高病毒負荷對NK細胞的活化有抑制作用，降低病毒負荷后，外周血NK細胞活性增強。 
   本研究中，同步觀察抗病毒治療HBV DNA下降的過程，外周血Treg細胞比例下降，并出現NK細胞NKG2D的表達上調和部分HBV 特異性CD4+T細胞功能的恢復，NK細胞、T細胞與Treg間的動態變化呈負相關。已有研究結果提示，Treg通過TGF-β的途徑，抑制NK細胞的功能，Treg細胞可下調NK細胞上NKG2D的表達。據此推測，病毒被抑制，Treg頻數下降有利于T細胞功能的恢復，同樣有利于NK細胞活性的恢復。NK細胞功能的恢復，是病毒載量下降直接影響，還是Treg下降后對NK細胞的抑制減弱，從而促進其功能恢復，還需進一步的研究。
本研究結果顯示非特異性免疫（Treg和NK）細胞的改變與HBeAg血清學陰轉無明顯相關性，非特異性免疫僅是改變了機體的免疫環境，促進了特異性免疫應答的恢復，并不直接影響HBeAg血清學轉換。而HBV特異性T細胞功能的恢復與HBeAg血清學轉換密切相關，進一步證實決定HBV感染轉歸的主要因素是HBV特異性T細胞免疫應答的強弱。 

   以上來源：鄭琦，朱月永，陳靖，劉豫瑞，游佳，曾達武，林蘇，江家驥。《抗病毒治療后慢性乙型肝炎患者外周血免疫細胞的改變與HBeAg血清學陰轉的關系》。《中華肝臟病雜志》。2012年11月第20卷第11期

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