蟾蜍靈抗癌作用機制研究進展

　　【摘要】蟾蜍靈是傳統中藥蟾酥的有效成分之一，國內外許多研究證實它對多種白血病細胞和一些實體惡性腫瘤細胞有顯著抑制增殖作用，其機制可能是通過抑制內皮細胞增生和血管生成、誘導細胞分化和凋亡等實現的。隨著研究的不斷深入，顯示蟾蜍靈具有廣泛的抗腫瘤作用，其發揮效用的濃度低，具有潛在的臨床應用價值。

　　蟾蜍靈是中藥蟾酥中提取的一種毒性配基，分子式為C24H34O4，相對分子質量為386.5，屬強心甙類物質。蟾酥是來源于中華大蟾蜍和黑眶蟾蜍雙腺分泌的漿液，這種成分具有抗癌、強心、抗炎、麻醉、增強免疫等作用，臨床上已廣泛應用于治療多種實體腫瘤、血液病、結核病、急性咽炎和慢性乙肝等疾病，還可以用于局部麻醉。蟾蜍靈作為蟾酥的有效抗癌成分之一，其作用機制成為國內外學者近年來的研究熱點，研究證實蟾蜍靈有抑制內皮細胞增生和血管生成、誘導腫瘤細胞分化及凋亡等作用，成為臨床潛在的抗癌新藥物。

　　1 抑制內皮細胞增生和血管形成
　　作為一種內皮細胞增生潛在的強有力抑制劑，應用蟾蜍靈作用原代培養的牛主動脈內皮細胞后，結果顯示蟾蜍靈能以劑量依賴方式抑制內皮細胞增殖及毛細管樣網絡結構形成，其抑制細胞增殖50%的藥物濃度為3 nmol/L。經圖像分析儀定量檢測，5 nmoL/L蟾蜍靈即可顯著抑制在含有I 型膠原的三維培養基質中牛主動脈內皮細胞形成毛細血管；流式細胞儀分析示蟾蜍靈能特異預防牛主動脈內皮細胞進入細胞增殖的G0、G1期，血管內皮細胞被阻滯于G2、M期，提示蟾蜍靈可能是通過抑制腫瘤血管形成實現抗腫瘤作用的。

　　2 誘導腫瘤細胞分化
　　朱志圖等應用蟾蜍靈與全反式維甲酸聯合誘導急性早幼粒細胞白血病原代細胞向成熟粒細胞分化，研究發現聯合用藥組較單獨應用全反式維甲酸時硝基四氮唑藍還原率增加了15%~52%，同時白細胞整合素CDllb表達增加了16%~69%，分化時間由7 d縮短為4 d，聯合組全反式維甲酸的濃度減少為單藥組的30%，可見蟾蜍靈明顯增強全反式維甲酸誘導分化作用，二者聯用表現出很強的協同作用。

　　2.1 抑制Na+、K+-ATP酶
　　研究中發現蟾蜍靈可以誘導人單核細胞白血病細胞THP-1分化成巨噬細胞樣細胞，蟾蜍靈通過抑制增生、黏附等誘導細胞分化，使白細胞介素-lβ和腫瘤壞死因子-α等炎性因子合成增多，細胞吞噬作用明顯增強，其形態和功能趨向于成熟的巨噬細胞；在此過程中蟾蜍靈下調原癌基因c-myb和c-myc表達，造成編碼轉錄因子原癌基因c-fos及Egr-1轉錄，引起THP-1細胞分化。當培養液中的Na+被Cl-取代后，即使蟾蜍靈濃度高達100 nmol/L，其作用在低鈉培養液中也不會出現，其原因可能在于低Na+培養液中，蟾蜍靈失去下調c-myb表達和誘導c-fos轉錄的能力，表明蟾蜍靈抑制Na+、K+-ATP酶使細胞內Na+濃度上升，觸發了原癌基因表達變化，進而引起細胞分化。

　　2.2 改變蛋白激酶活性
　　蟾蜍靈還可通過蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)調節細胞分化，研究表明PKC特異性非選擇性抑制劑Ro-31-8220和經典型蛋白激酶C選擇性抑制劑G0-6976可以明顯弱化蟾蜍靈誘導單核細胞白血病THP-1細胞的白細胞介素-1β基因表達，提示PKC參與了蟾蜍靈誘導細胞分化的作用。

　　2.3 改變VDR基因
　　Nakano等通過應用蟾蜍靈聯合1，25-二羥基維生素D，作用于HL-60細胞后發現，蟾蜍靈可增強其所致的核受體維生素D受體(vitamin D nuclear receptor，VDR)靶基因表達，并可以有效誘導分化表型，VDR是一種有效誘導髓系白血病細胞分化的配體，Amano等進一步研究發現，有絲分裂原激活蛋白也能增強1，25-二羥基維生素D3所致的VDR靶基因表達，但對蟾蜍靈和l，25-二羥基維生素D3聯合組卻沒有影響，表明蟾蜍靈誘導HL-60細胞分化亦受有絲分裂原激活蛋白激酶的影響。

　　3 誘導腫瘤細胞凋亡
　　國內外研究表明蟾蜍靈可以明顯抑制K562、U937和HL-60等白血病細胞以及結腸癌、卵巢癌、肺癌、胃癌等實體瘤細胞增殖并誘導其凋亡。

　　3.1 抑制Na+、K+-ATP酶
　　Kawazoe等¨用1 μmol/L蟾蜍靈處理白血病THP-1細胞、MOLT-3細胞及結腸癌Colo320DM細胞3 h后，細胞內Na+濃度發生改變，細胞膜電位下降，但直到6 h未發現線粒體電位改變及細胞色素C釋放，提示蟾蜍靈可能通過抑制Na+、K+-ATP酶進一步發揮作用。Li等發現蟾蜍靈呈劑量依賴性抑制肝癌細胞增殖，且與肝癌細胞中Na+、K+-ATP α3酶的表達水平呈正相關，表明Na+、K+-ATP α3很可能成為蟾蜍靈對肝癌治療靶點之一。

　　3.2 活性氧依賴凋亡途徑
　　Sun等研究發現，經蟾蜍靈作用人肺腺癌細胞ASTC-a-1后，可明顯增加線粒體活性氧(reactive oxygen specie，ROS)產量，引起Bax移位及線粒體膜電位丟失，從而活化半胱天冬酶(caspase)-3；但如果除去ROS，仍有部分caspase-3被活化，表明除了ROS依賴的caspase-3活化途徑外還有一些其他途徑激活caspase-3而引起細胞凋亡。

　　3.3 Tiam 1基因
　　T淋巴瘤侵襲轉移誘導因子1(T-lymphom invasion and metastasis gene，Tiam 1)是癌基因家族Db l的鳥嘌呤核酸轉換因子之一。Cao-Hong等用0.01μmol/L蟾蜍靈處理HeLa細胞半小時，通過RT-PCR發現Tima 1 mRNA和Tima 1蛋白均表達，而轉染Tima 1特異siRNA的HeLa細胞明顯抑制蟾蜍靈誘導凋亡作用，證實Tima 1基因在蟾蜍靈引起的Hela胞株凋亡中起關鍵作用。

　　3.4 改變蛋白激酶活性
　　PKC參與細胞增殖、細胞分化及凋亡的調控，其作用因刺激因子、細胞內在固有程序、底物特異性及同工酶表達的不同而不同。經蟾蜍靈處理cPKC β和nPKC δ缺失的單核細胞白血病THP-1細胞后并不產生細胞凋亡的重要標志DNA ladder，若加用nPKC δ特異性抑制劑后則可以明顯弱化蟾蜍靈的早期誘導凋亡作用。

　　蛋白激酶B是一種絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，又稱Akt，有抑制凋亡的作用。Li等研究發現80 nmol/L蟾蜍靈作用胃癌MGC803細胞1~16 h，磷酸化Akt蛋白在1 h和8 h表達輕微上調，至16 h完全消失，而總的Akt蛋白水平沒有明顯改變，提示蟾蜍靈可通過抑制PI3 K-Akt信號通路誘導凋亡。

　　研究表明，蟾蜍靈可以通過抑制促細胞絲裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路的活性間接達到抑制腫瘤細胞的遷徙及浸潤轉移。蟾蜍靈亦可通過MAPK通路的異�；罨�促使細胞凋亡，首先是MAPK的活化，提高Ras、Raf-1的活力，并產生MAPK激酶，這些酶由于蟾蜍靈的作用而被短暫活化，信號傳遞可能從Ras、Raf-1、MAPK
激酶，再到MAPK。研究中同時發現細胞中環磷腺苷的含量顯著降低，用能增加細胞中環磷腺苷濃度的福司珂林和3-異丁基-1-甲基黃嘌呤預處理U937細胞后，再用蟾蜍靈處理，則致Raf-1活力的下降和DNA破壞，表明Raf-1也可能是通過環磷腺苷依賴的蛋白激酶的磷酸化作用程度減少而被活化。

　　3.5 調節凋亡相關基因表達
　　蟾蜍靈可通過改變凋亡相關基因表達誘導多種人腫瘤細胞株的凋亡。Huang等最近發現蟾蜍靈可通過影響cyclin D、cyclin E、CDK2、CDK4、caspase-3、caspase-7、caspase-9等表達引起人膀胱癌細胞的凋亡。

　　Yan等進行的蟾蜍靈聯合腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)對乳腺癌細胞增殖抑制及凋亡實驗中觀察到，選取對TRAIL耐藥的乳腺癌細胞株MCF-7和MDA-MB-231，通過聯合蟾蜍靈可明顯活化TRAIL誘導的細胞凋亡；在誘導細胞凋亡過程中，顯著上調了死亡受體DR4及DR5表達，進一步通過基因轉染實驗證實抑制泛素連接酶Cbl家族蛋白之一Cbl-b可調控ERK、JNK及p38 MAPK蛋白活性，更明顯上調DR4及DR5表達，增強細胞凋亡作用。

　　Qi等應用蟾蜍靈和華蟾素誘導肝癌細胞株HepG凋亡的過程中發現，線粒體膜電位破壞及凋亡信號分子Fas、Bax和Bid表達增加，Bcl-2表達減少，細胞色素C釋放，caspase~3、caspase~8、caspase-9和caspase-10被活化，以及PARP聚合酶的裂解活化。進一步應用caspase-3、caspase-8、caspase-9、caspase-10抑制劑后發現蟾蜍靈可顯著阻斷這些蛋白酶抑制劑并誘導細胞凋亡，表明Fas-FasL通路和線粒體介導的細胞凋亡途徑可能是蟾蜍靈誘導細胞凋亡的通路之一。

　　4 結語
　　蟾蜍靈既能誘導腫瘤細胞分化又能誘導腫瘤細胞凋亡，但目前的報道多為體外細胞實驗，涉及動物體內抗癌的研究較少，其抗腫瘤的機制復雜，關系到多種基因信號轉導通路的調控。隨著分子生物學及其他相關學科的發展，有關蟾蜍靈抗腫瘤分子機制必將會進一步闡明。蟾蜍靈發揮效用的濃度低，對正常細胞無誘導凋亡作用，具有潛在的臨床應用價值。（來源：國際腫瘤病學雜志2012年9月 第39卷 第9期 《蟾蜍靈抗癌作用機制研究進展》郁云龍 溫冰 朱志圖）

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