尖銳濕疣確認主要依靠臨床病毒DNA檢測

    尖銳濕疣（CA）是由人乳頭瘤病毒（HPV）感染引起的鱗狀上皮增生性疣狀病變，有80多種抗原型。外陰尖銳濕疣的發病率明顯增高，已成為常見女性性傳播疾病。潮濕的外陰皮膚易于HPV的生長：妊娠、糖尿病、影響細胞免疫功能的全身疾病時，尖銳濕疣生長迅速，且不易控制。HPV除可引起生殖道的尖銳濕疣外，還可能與生殖道腫瘤的癌前病變有關，尤其是HPV16、18型與外陰癌、宮頸癌的更為密切，已對婦女身心健康造成嚴重影響，應引起全社會足夠的重視。 

    在衛生部所頒布的《尖銳濕疣的診療原則》里也沒有“病毒與血液有關”的描述，所以一般診斷尖銳濕疣或檢測是否有病毒，不必對血液進行檢測，臨床證明血液化驗的陽性或陰性結果并不能準確反映病毒存在的實際情況。尖銳濕疣的確切診斷主要還是要依靠臨床病毒DNA檢測、醋酸白實驗或病理學檢查來確診。下面由百濟藥師為你一一詳細介紹

一、醋酸白試驗
　　用3-5%醋酸外涂疣體2-5分鐘，病灶部位變白稍隆起，肛門病損可能需要15分鐘。本試驗的原理是蛋白質與酸凝固變白的結果，HPV感染細胞產生的角蛋白與正常的未感染上皮細胞產生的不同，只有前者才能被醋酸脫色。醋酸白試驗檢測HPV的敏感性很高，它比常規檢測觀察組織學變化還好。但偶爾在上皮增厚或外傷擦破病例中出現假陽性、假陽性變白跡象顯得界限不清和不規則。美國CDC提示，醋酸白試驗并不是特異試驗，且假陽性較常見。

　　二、免疫組織學檢查
　　常用過氧化物酶抗過氧化物酶方法（即PAP），顯示濕疣內的病毒蛋白，以證明疣損害中有病毒抗原。HPV蛋白陽性時，尖銳濕疣的淺表上皮細胞內可出現淡紅色的弱陽性反應。

　　三、組織化學檢查
　　取少量病損組織制成涂片，用特異抗人類乳頭瘤病毒的抗體作染色。如病損中有病毒抗原，則抗原抗體結合。在過氧化物酶抗過氧化物酶（PAP）方法中，核可被染成紅色。此法特異性強且較迅速，對診斷有幫助。

　　四、病理檢查
　　主要為角化不全，棘層高度肥厚，乳頭瘤樣增生，表皮突增厚，延長，其增生程度可似假性上皮瘤樣。刺細胞和基底細胞并有相當數量的核分裂、頗似癌變。但細胞排列規則，且增生上皮和真皮之間界限清楚。其特點為粒層和刺層上部細胞有明顯的空泡形成。此種空泡細胞較正常大，胞漿著色淡、中央有大而圓，深嗜堿性的核。通常真皮水腫、毛細血管擴張以及周圍較致密的慢性炎性浸潤。Bushke-loewenstein巨大型尖銳濕疣，表皮極度向下生長，代替了其下面的組織、易與鱗狀細胞相混，故須多次活檢。若有緩慢發展之傾向，則為一種低度惡變的過程，即所謂疣狀癌。

　　五、基因診斷
　　迄今，HPV難于用傳統的病毒培養及血清學技術檢測，主要實驗診斷技術是核酸雜交。近年來發展的PCR方法具有特異、敏感、簡便、快速等優點，為HPV檢測開辟了新途徑。

　　（一）標本的采集及處理
　　1．標本的采集和預處理：用刮板或生理鹽水浸潤的棉棒從陰道和宮頸外口取分泌物和細胞。在作細胞學檢查的同時，將標本放入5ml含有0.05%硫柳汞的PBS中，用PBS離心（3000g，10min）洗滌2次，沉積細胞重懸于1mlPBS中，取0.5ml細胞懸液抽提DNA。

　　2．標本核酸的提�。喊�1體積細胞懸液加10倍體積的細胞裂解液（10mmol/L　Tris-HCl，pH 7.4，10mmol/L EDTA，150mmol/L NaCl，0.4%SDS，1.0mg/ml蛋白酶K）37℃下處理過夜;且等體積酚/氯仿（1:1），氯仿/異戊醇（24:1）各抽提2次；加1/10體積3mol/L　NaAc（pH 5.2）及2.5倍體積無水乙醇置-20℃ 2h或過夜沉淀DNA；加1體積乙醇洗滌1次；用60μl含RNA酶（100μg/ml）的TE液（10mmol/L　Tris-HCl，pH 8.0，1.0mmol/L EDTA）溶解DNA，37℃溫育30min。

　　（二）PCR擴增
　　1． 引物設計和合成：HPV基因組可分為早期區（E）和晚期區（L），每區含一系列開放讀碼框架（ORF）。序列分析表明，各型HPV的非編碼區及E1、E6、E7和L1區均有保守序列。Manos等從HPVL1區中選擇保守序列設計合成引物MY11和MY09見表1，該引物與HPV 6、11、16、18及33型有互補序列，也可擴增其它型HPV。

　　Manos等設計的HPVL1通用引物
　　MY11：GCMCAGGGWCATAAYAATGG
　　MY09：CGTCCMARRGGAWACTGATC

　　2．PCR反應試劑：Taq DNA聚合酶（2U/ml）、10mmol/L dNTP貯備液（dATP、dCTP、dGTP、dTTP各10mmol/L），10×PCR緩沖液（500mmol KCl、40mmol/L MgCl2、100mmol/L Tris-HCl、pH 8.5），100μmol/L MY11和MY09貯備液，滅菌的玻璃蒸餾器制備的蒸餾水。

　　3．PCR擴增方法和程序：以100μl PCR反應液''用無菌0.5ml硅化塑料離心管為反應管進行擴增反應。
　�。�1）實驗前配制預混反應試劑并分裝。預混反應試劑包括除標本DNA外的其它各種PCR反應試劑。
　�。�2）各反應管依次加入10μl標本和90μl預混反應試劑。
　�。�3）加入80-100μl石蠟油，在臺式離心機上快速離心數秒鐘，使各反應試劑收集于油層下。目前，PCR試劑已商品化，反應體積為25μl。使用時只加入標本DNA即可。
　　（4）將反應管置PCR擴增儀上，循環參數為95℃ 30s，55℃ 40s，72℃ 50s循環35次，最后72℃延伸5min。

　　4．每次試驗應設陽性及陰性對照。以載有HPV的重組質粒（每反應為100pg）或含有HPV的細胞系（如Caski、HeLa）DNA為陽性對照，以無HPV的人細胞系DNA為陰性對照。

　�。ㄈ�）擴增產物的檢測和分析
　　1． 凝膠電泳：擴增反應結束后，取出反應管，冷卻至室溫，取10μl擴增產物用5%-7%聚丙烯酰胺凝膠或1.5%瓊脂糖電泳，溴化乙錠染色，紫外分析儀下分析結果，分子量約為450bp處出現明顯的DNA帶。

　　2． 核酸雜交：如果凝膠電泳無清楚的DNA或需確定DNA帶的特異性時，可用標記的公用混合探針和（或）型特異探針作Southern吸印雜交、斑點雜交驗證。

　　按照標準方法制32P ATP標記的寡核苷酸探針，需達到約107cpm/pmol特異活性。雜交液中需含有2×106-5×106cpm探針/ml。在55℃緩慢振蕩下雜交2-3h，隨后于30-55℃下用洗滌液（2×SSC、0.1%SDS）迅速沖洗雜交膜，除去多余探針。然后進行洗膜，其條件依所用探針而異：公用混合探針，55℃洗膜10min；MY12、MY13及MY16探針，56-57℃下10 min，并換液重洗1次；MY14及WD74探針，58-59℃下10min，亦換液重洗1次。

　　用PCR方法檢測HPV比核酸雜交方法優越。其敏感性高，GP-PCR方法以凝膠電泳直接分析結果，可檢出標本中200個拷貝的HPV DNA，若以核酸雜交檢測PCR產物，敏感性提高，能檢出10個拷貝的HPV DNA。

　　鑒于PCR技術的高度敏感性，以生殖道脫落細胞為檢材足以滿足試驗要求，避免了活檢取材、研磨組織繁雜操作。一般情況下，PCR擴增產物經凝膠電泳，觀察產生的DNA可直接作出診斷。因此，PCR技術檢測HPV實驗周期短、簡便快速。

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