通絡(luò)生骨膠囊預(yù)防激素性股骨頭缺血性壞死的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)

摘要：目的 探討通絡(luò)生骨膠囊對(duì)激素性股骨頭缺血性壞死的預(yù)防作用。方法 建立大鼠激素性股骨頭缺血性壞死模型。SD大白鼠120只隨機(jī)分成正常組、模型組、安妥明組、通絡(luò)生骨膠囊高、中、低劑量組。每周注射激素1次，每日灌胃藥物1次。于實(shí)驗(yàn)后第4周、第8周、第12周分3批處死動(dòng)物，進(jìn)行股骨頭大體形態(tài)及光鏡檢查，墨汁灌注透明片觀察，并用全自動(dòng)圖象分析處理系統(tǒng)進(jìn)行病理圖象的分析處理、骨的組織形態(tài)學(xué)和計(jì)量學(xué)分析。結(jié)果 通絡(luò)生骨膠囊各組骨小梁質(zhì)量較好，與正常組基本一致；空骨陷窩率較模型組顯著降低；股骨頭髓腔中脂肪變性程度較模型組明顯減輕；軟骨下血管計(jì)數(shù)及軟骨下區(qū)小血管直徑與模型組比較有顯著增加（P<0.01），光鏡下小血管結(jié)構(gòu)較模型組完整，無(wú)明顯髓腔內(nèi)出血征象；墨汁灌注透明片顯示血管密度較模型組及安妥明應(yīng)用組顯著增高（P<0.01）；成骨細(xì)胞計(jì)數(shù)較模型組顯著增加（P<0.01），破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)較模型組顯著降低（P<0.01）。結(jié)論 通絡(luò)生骨膠囊對(duì)激素性股骨頭缺血性壞死有明顯的預(yù)防作用。

    通絡(luò)生骨膠囊是廣州中醫(yī)藥大學(xué)袁浩教授在挖掘民間用藥經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上結(jié)合多年臨床實(shí)踐篩選出來(lái)的治療股骨頭缺血性壞死的有效方藥，該方由單味藥木豆葉組成，具有補(bǔ)腎健骨、活血化瘀、消腫止痛的功效。本文研究通絡(luò)生骨膠囊預(yù)防激素性股骨頭缺血性壞死的藥效學(xué)，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
 
l 材料與方法 
    1.1藥品與試劑 通絡(luò)生骨膠囊，0.5 g/粒，廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥與保健研究所提供，批號(hào)960227，用水溶解，調(diào)制成懸浮液；醋酸強(qiáng)的松龍，江蘇揚(yáng)州制藥廠生產(chǎn)，批號(hào)970397；安妥明，廣州明興制藥廠生產(chǎn)，批號(hào)971001。 
  
    1.2動(dòng)物 健康純種SD大白鼠120只，體重250～300 g，雌雄各半，由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供動(dòng)物，合格證號(hào)96A02。 
 
    1.3主要儀器 Olypotums光學(xué)顯微鏡；Mortmoph全自動(dòng)圖象分析系統(tǒng)；Leica全自動(dòng)照相系統(tǒng)，美國(guó)，Leica公司。 

 
    1.4方法 
    1.4.1造模、分組與給藥 SD大白鼠120只，隨機(jī)分為6組：正常組，模型組，安妥明組，通絡(luò)生骨膠囊高劑量組、中劑量組、低劑量組。除正常組外，各組均每周1次注射醋酸強(qiáng)的松龍（24.5 mg/kg）造模，在造模同時(shí)，各給藥組均按表1劑量灌胃給藥，模型組和正常組給予等量生理鹽水。 
 
    1.4.2檢測(cè)指標(biāo) 于實(shí)驗(yàn)后第4周、第8周、第12周分3批處死動(dòng)物。進(jìn)行股骨頭大體觀察（包括骨頭外形，關(guān)節(jié)軟骨色澤、外形）和組織學(xué)觀察。病理組織制片：將股骨頭沿冠狀面劈開，用10％的福爾馬林固定，5％ 的硝酸溶液脫鈣，石蠟包埋，切片后一份作HE染色，一份做V.G染色，一份作Masson三色染色。墨汁灌注透明標(biāo)本制備：將動(dòng)物用戊巴比妥鈉麻醉后，取腹部正中切口，顯露腹主動(dòng)脈和下腔靜脈，分別插上導(dǎo)管，經(jīng)腹主動(dòng)脈持續(xù)恒壓注入37.2 ℃肝素生理鹽水，直到下腔靜脈導(dǎo)管流出清澈溶液，再灌入2.5％ 戊二醛溶液，最后注入墨汁至老鼠雙足趾甲下顏色轉(zhuǎn)黑。取出股骨頭放于4 ℃的冰箱中24 h，用10％ 甲醛固定，鹽酸混合液脫鈣，酒精逐級(jí)脫水，制成30 μm冠狀面連續(xù)切片，再經(jīng)二甲苯透明后封片。 
 
    1.5統(tǒng)計(jì)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用“χ(-)±s”表示，結(jié)果采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理，統(tǒng)計(jì)方法為方差分析、q檢驗(yàn)。
 
2 結(jié)果 
    2.1大體觀察 在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中，無(wú)一例股骨頭出現(xiàn)塌陷，模型組股骨頭關(guān)節(jié)軟骨微黃，少光澤，甚至軟骨下有暗紅瘀斑，但無(wú)塌陷，12周標(biāo)本較第4周易切鑿。 
 
    2.2鏡下觀察 （1）正常組：骨小梁整齊清晰，排列規(guī)則，致密飽滿；骨細(xì)胞清晰可見，偶見骨陷窩空虛；軟骨下血管較豐富，結(jié)構(gòu)清晰；髓腔內(nèi)生血細(xì)胞豐富；骨小梁周沿成骨細(xì)胞數(shù)量多；墨汁灌注標(biāo)本顯示毛細(xì)血管豐富，交織成網(wǎng)狀，邊緣清晰。 
 
    （2）模型組：骨小梁稀疏，變細(xì)，甚至斷裂，結(jié)構(gòu)紊亂，有碎片；骨細(xì)胞壞死，空骨陷窩明顯增多；軟骨下血管數(shù)量明顯減少，管壁結(jié)構(gòu)破壞，彈性纖維斷裂。髓腔內(nèi)脂肪細(xì)胞體積增大，有的融合成泡狀，生血細(xì)胞數(shù)量減少；骨小梁周沿成骨細(xì)胞數(shù)量很少，髓腔內(nèi)多核破骨細(xì)胞數(shù)量增多；墨汁灌注標(biāo)本顯示毛細(xì)血管稀疏，邊緣不清，血竇欠豐富，數(shù)量少；上述病理表現(xiàn)隨著時(shí)間的推移逐漸加重。 
  
    （3）安妥明組：骨小梁細(xì)長(zhǎng)，偶有斷裂；空骨陷窩較少，但仍可見；骨髓內(nèi)生血細(xì)胞無(wú)明顯空泡變性；成骨細(xì)胞數(shù)量及破骨細(xì)胞數(shù)量較少，骨小梁周沿?zé)o明顯新骨沉積生長(zhǎng)；軟骨下血管數(shù)量欠豐富，軟骨下髓腔內(nèi)亦可見陳舊出血跡象；墨汁灌注標(biāo)本毛細(xì)血管數(shù)量較少，血竇欠豐富，數(shù)量少，無(wú)明顯墨汁彌散。 
 
    （4）通絡(luò)生骨膠囊組：①高劑量組骨小梁排列整齊，規(guī)則，致密飽滿，無(wú)碎裂；中劑量排列尚整齊規(guī)則，但稍欠飽滿；低劑量可見部分稀疏瘦長(zhǎng)征象。 
 
    ②高劑量組骨小梁上骨細(xì)胞核清晰可見，位于中央，少見空骨陷窩存在，與正常組比較無(wú)顯著性差異（P>0.05）；中、低劑量組可見部分空骨陷窩，但明顯少于模型組（P<0.01）。③ 軟骨細(xì)胞排列整齊，軟骨下血管豐富，Masson三色與V.G染色示小血管壁清晰正常。④髓腔內(nèi)造血細(xì)胞豐富，無(wú)明顯大的脂肪滴；⑤骨小梁周沿梭形成骨細(xì)胞數(shù)量增多，排列致密，Masson三色提示骨小梁周沿有一層具有活性的新生骨存在；⑥墨汁透明標(biāo)本顯示毛細(xì)血管致密，邊沿清晰，血竇豐富，數(shù)量多，周沿?zé)o明顯墨汁彌散；各時(shí)間點(diǎn)病理表現(xiàn)無(wú)明顯差別。結(jié)果見表1～3。

3 討論
    Pietrogrand和Mastomarine于1957年首先報(bào)告了短期大劑量使用激素可引導(dǎo)起股骨頭壞死，其主要表現(xiàn)為出現(xiàn)明顯的空骨陷窩，骨小梁稀疏、碎裂，甚至出現(xiàn)了整塊死骨，髓腔生血細(xì)胞廣泛脂肪空泡化，血管密度、結(jié)構(gòu)均有顯著破壞。目前認(rèn)為激素導(dǎo)致凝溶紊亂、血液流變性改變，高血脂血癥與微血栓的形成，NO合成減少與血栓的形成，最后使股骨頭血供異常，因營(yíng)養(yǎng)供給不足、不能及時(shí)將代謝產(chǎn)物清除而致股骨頭細(xì)胞壞死，但發(fā)病機(jī)理仍未能完全闡明。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M出現(xiàn)以上顯著表現(xiàn)，提示單純激素足已導(dǎo)致骨壞死。 
  
    安妥明又名氯苯丁脂，是一種降血脂藥物，早在1978年Wang應(yīng)用脂質(zhì)清除劑安妥明治療兔激素性股骨頭缺血性壞死，認(rèn)為能抑制骨髓脂肪細(xì)胞病理性肥大，改善股骨頭血運(yùn)。周謀望等認(rèn)為是安妥明改善了激素所致的脂質(zhì)代謝紊亂，從而保護(hù)股骨頭骨細(xì)胞免受激素?fù)p傷。本實(shí)驗(yàn)也表明安妥明對(duì)于髓腔生血細(xì)胞的脂肪化是有一定效果的，可抑制空骨陷窩率降低，但不能提高血管的數(shù)量、周徑、血管密度與直徑，說(shuō)明其對(duì)血管無(wú)保護(hù)作用。 
  
    通絡(luò)生骨膠囊3個(gè)劑量組可提高空骨陷窩率、骨小梁面積、血管密度、軟骨下小血管的數(shù)量與直徑、成骨細(xì)胞計(jì)數(shù)等，說(shuō)明通絡(luò)生骨膠囊具有預(yù)防激素性股骨頭壞死的作用。Satio認(rèn)為反復(fù)的髓腔內(nèi)出血與股骨頭缺血性壞死的發(fā)病機(jī)理密切相關(guān)，小動(dòng)脈的血管壁結(jié)構(gòu)損害和血管組織破裂的痕跡被認(rèn)為是股骨頭壞死的特征表現(xiàn)，并且和髓腔內(nèi)出血及骨小梁、骨髓壞死密切相關(guān)。本組實(shí)驗(yàn)中模型組軟骨下的小動(dòng)脈出現(xiàn)了內(nèi)膜增生、中膜變性、平滑肌細(xì)胞壞死，肌纖維斷裂以及反復(fù)的髓腔內(nèi)出血，墨汁灌注標(biāo)本出現(xiàn)區(qū)域性的墨汁缺乏現(xiàn)象，說(shuō)明激素在導(dǎo)致股骨頭缺血性壞死過(guò)程中，血管的損害（包括破裂和栓塞）是一個(gè)相當(dāng)重要的環(huán)節(jié)，而通絡(luò)生骨膠囊各劑量組動(dòng)物這種現(xiàn)象得到了大大抑制與改善。我們的前期研究曾發(fā)現(xiàn)通絡(luò)生骨膠囊能顯著提高大鼠腸系膜微循環(huán)的血液流速、流速微積分和流態(tài)微積分；還能降低大鼠急性血瘀模型的全血比粘度、血漿比粘度和血沉；結(jié)合本試驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)可能是由于通絡(luò)生骨膠囊具有明顯的活血化瘀作用，能顯著促進(jìn)血管生長(zhǎng)，使壞死組織再血管化，保護(hù)和改善了血管結(jié)構(gòu)，保證了組織的有效灌注，使骨細(xì)胞得以進(jìn)行正常的代謝而預(yù)防了壞死。 
  
    大量激素導(dǎo)致股骨頭內(nèi)的骨細(xì)胞壞死，同時(shí)也抑制了成骨細(xì)胞的活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通絡(luò)生骨膠囊組的成骨細(xì)胞數(shù)顯著高于模型組，Masson三色染色切片中，壞死的骨小梁周圍出現(xiàn)了充滿活性的新生骨，這說(shuō)明通絡(luò)生骨膠囊能夠激發(fā)成骨細(xì)胞的活性，調(diào)節(jié)骨的代謝，促進(jìn)新骨生長(zhǎng)，使成骨細(xì)胞數(shù)量增多，從而促進(jìn)新生骨的形成，維持了骨組織的力學(xué)框架，這可能是通絡(luò)生骨膠囊治療激素性股骨頭壞死另一個(gè)原因。 
  
    綜上所述，通絡(luò)生骨膠囊對(duì)激素性股骨頭缺血性壞死有明顯的預(yù)防作用，其作用途徑可能是：（1）保護(hù)和改善微循環(huán)，保證了骨組織的有效灌注，使由于脂質(zhì)代謝紊亂帶來(lái)的有毒物質(zhì)及時(shí)得到轉(zhuǎn)輸與排泄，給骨細(xì)胞生長(zhǎng)提供一個(gè)良好的內(nèi)外環(huán)境。（2）增強(qiáng)骨細(xì)胞的活力，預(yù)防了骨細(xì)胞內(nèi)脂肪的異常堆積，激發(fā)成骨細(xì)胞活性、調(diào)節(jié)骨的代謝、促進(jìn)骨的生長(zhǎng)，保持了骨小梁的完整結(jié)構(gòu)。

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