姜黃素對人子宮肌瘤細胞增殖、凋亡的影響及機制探討

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盛順良，莫湘瓊，歐陽新平，何平平，李卓，周建斌

(1南華大學附屬第二醫院，湖南衡陽421001；2中山大學附屬第五醫院；

3南華大學醫學院；4南華大學附屬第一醫院)

(山東醫藥2012年第52卷第34期：27-29)

【摘要】目的 觀察姜黃素對人子宮肌瘤細胞增殖和凋亡的影響，并探討其機制。方法 將對數生長期的人子宮肌瘤細胞分為兩組，觀察組加入終濃度分別為10、50、100 μmol/L的姜黃素，對照組加入1‰的二甲基亞砜(DMSO)，分別于培養12、24、48、72 h后，采用MTF法測算細胞增殖抑制率，用流式細胞術檢測細胞凋亡率。將對數生長期的細胞隨機分為3組，A組加入終濃度100 μmol/L的姜黃素，B組加入100 μmol/L的線粒體ATP敏感鉀通道開放劑二氮嗪及100 μmol/L的姜黃素，C組加500 μmol/L的線粒體ATP敏感鉀通道阻斷劑5-羥基癸酸脫氫酶(5-HD)及100 μmo]/L的姜黃素；培養48 h后，分別采用MTT法和流式細胞儀測算細胞增殖抑制率和凋亡率。結果 隨著姜黃素濃度的增加和作用時間的延長，細胞增殖抑制率逐漸減低(P均＜0.05)，而細胞凋亡率逐漸增加(P均＜0.05)。A組細胞增殖抑制率和凋亡率分別為75.65%±9.42%、41.82%±6.12%，B組分別為17.66%±2.45%、32.46%±6.71%，C組分別為40.67%±5.46%、74.42%±8.47%，B組與A、C組比較，P均＜0.05。結論 姜黃素可抑制人子宮肌瘤細胞增殖并促進其凋亡，該作用可能與姜黃素抑制線粒體ATP敏感鉀通道有關。

【關鍵詞】姜黃素；線粒體ATP敏感鉀通道；細胞凋亡；細胞增殖；人子宮肌瘤細胞

目前，研究認為子宮肌瘤是一種雌激素依賴性腫瘤，在生育期發生、發展，在絕經后逐漸萎縮；然而使用抗雌激素治療效果并不理想，因此尋求新的、有效的治療或輔助用藥具有十分重要的意義。姜黃素是從中藥姜黃中提取的一種植物多酚，研究發現其對多種腫瘤細胞均具有抑制作用。研究表明，線粒體ATP敏感鉀通道在細胞凋亡中發揮十分重要的作用。2012年2~7月，我們觀察了姜黃素對人子宮肌瘤細胞增殖和凋亡的影響，并探討線粒體ATP敏感鉀通道在其中的作用。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 姜黃素、線粒體ATP敏感鉀通道開放劑二氮嗪、線粒體ATP敏感鉀通道抑制劑5-羥基癸酸脫氫酶(5-HD)均購自美國Sigma公司；DMEM培養基(Invitrogen公司，美國)，胎牛血清(杭州四季青公司，中國)，I型膠原酶、胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMSO)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)均為Sigma公司(美國)產品；CO₂細胞培養箱(Becton-Dickinson，美國)，電子天平(Satorius，日本)，低溫高速離心機(Ependoff，美國)，流式細胞測定儀(Becton-Dickinson，美國)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的制備與培養 無菌條件下，將手術切除的肌瘤組織用含抗生素的PBS沖洗3遍，剪碎至體積＜1 mm³；加入含800 U/mL I型膠原酶的DMEM培養液于37℃消化肌瘤組織6 h，其間每隔1 h吹打1次；消化結束后以1500 r/min離心10min，收集細胞；用臺盼藍染色，觀察細胞活性并記數；用培養液調整細胞濃度為5×10⁵/mL，接種于24孔細胞培養板，每孔1 mL。培養液中加入10%胎牛血清，將細胞培養板置于37 ℃、5%CO₂培養箱中培養。細胞經免疫組化兩步法DAB顯色，鑒定為子宮肌瘤細胞。根據細胞生長狀態每2~3 d傳代1次。取生長狀態穩定，呈對數生長期的細胞用于實驗。

1.2.2 姜黃素對子宮肌瘤細胞增殖影響的觀察 采用MTT法。取對數生長期的細胞，以2×10³/孔接種96孔板，培養24 h；將姜黃素用1‰的DMSO溶解后，加入適量的DMEM培養液稀釋。待細胞貼壁后，觀察組加入終濃度分別為10、50、100 μmol/L的姜黃素，對照組加入1‰的DMSO，每組設3個復孔。分別于培養12、24、48、72 h后，加入5 mg/mL的MTT 10 μL；培養4 h后棄去培養液，加入0.1 mLDMSO；待結晶完全溶解后，在Bio-Rad550酶聯免疫檢測儀上以570 nm和630 nm雙波長測定每孔的吸光度(A)值。增殖抑制率=(1-觀察組A值/對照組A值)× 100%。

1.2.3 姜黃素對子宮肌瘤細胞凋亡影響的觀察 采用流式細胞儀檢測。取對數生長期的子宮肌瘤細胞，以2×10³/孔接種96孔板，培養24 h；待細胞貼壁后，觀察組加入終濃度分別為10、50、100 μmol/L，對照組加入1‰的DMSO，每組設3個復孔。分別培養12、24、48、72 h后，收集各組細胞，加入適量的PBS緩沖液，1500 r/min離心5 min，棄上清，此步驟反復2次。加入500 L的Binding Buffer懸浮細胞，再加入5 μL Annexin V混勻后，加入5 μL PI，混勻；室溫、避光、反應15 min后，1 h內進行流式細胞儀的檢測。觀察Annexin V/PI染色陽性細胞數，計算其占總細胞數的百分比，即為細胞凋亡率。

1.2.4 ATP敏感鉀通道對姜黃素對子宮肌瘤細胞凋亡和增殖影響的觀察 取對數生長期的細胞，隨機分為3組；A組加人終濃度100 μmol/L的姜黃素，B組加入100 μmol/L的二氮嗪、100 μmol/L的姜黃素，C組加500 μmol/L的5-HD、100 μmol/L的姜黃素；培養48 h后，采用采用MTT法和流式細胞儀檢測細胞增殖和凋亡情況，方法同1.2.2、1.2.3。

1.2.5 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件。數據以x(-)±s表示，組間比較用單因素方差分析；兩兩比較采用SNK-q檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 姜黃素對人子宮肌瘤細胞增殖的影響 隨著姜黃素濃度的增加和作用時間的延長，細胞增殖抑制率逐漸減低(P均＜0.05)。見表1。

2.2 姜黃素對人子宮肌瘤細胞凋亡的影響 對照組細胞凋亡率為8.14%±1.17%，觀察組用l0、50、100 μmol/L的姜黃素處理48 h后細胞凋亡率分別為19.66%± 3.72%、41.82%±6.12%、61.52%±7.34%，50 μmol/L的姜黃素處理12、24、48、72 h后細胞凋亡率分別為16.75%±1.84%、28.56%±4.21%、41.82%±6.12%、59.33%±7.11%；觀察組與對照組比較，P均＜0.05；觀察組隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長，細胞凋亡率逐漸增加(P均＜0.05)。

2.3 ATP敏感鉀通道開放劑和阻斷劑對姜黃素作用的影響 A組細胞增殖抑制率和凋亡率分別為75.65%±9.42%、41.82%±6.12%，B組分別為17.66%±2.45%、32.46%±6.71%，C組分別為40.67%±5.46%、74.42%±8.47%，B組與A、C組比較，P均＜0.05。

3 討論

子宮肌瘤是女性生殖系統最常見的良性腫瘤，其治療以手術為主，但對于有生育要求的患者，手術治療受到一定的限制。姜黃素是從中藥姜黃的根莖中提取的一種脂溶性酚類色素，是姜黃的主要活性成分。研究顯示，姜黃素具有廣泛的藥理作用，包括抗氧化、抗炎、抗動脈粥樣硬化、抗纖維化、抗病毒、保護肝腎功能等作用。近年來研究發現，姜黃素能抑制多種腫瘤細胞的生長，誘導部分腫瘤細胞分化和凋亡，是一種有開發前景的天然抗腫瘤新藥。本研究結果顯示，姜黃素以濃度和時間依賴的方式抑制人子宮肌瘤細胞的增殖，促進人子宮肌瘤細胞的凋亡，表明姜黃素有望作為子宮肌瘤保守治療的藥物。

細胞凋亡是指由基因控制的細胞自主的、有序的死亡。細胞凋亡是個主動過程，涉及一系列基因的激活、表達以及調控等。研究表明，線粒體ATP敏感鉀通道調控著細胞的凋亡和增殖。有研究發現，線粒體ATP敏感鉀通道的開放引起線粒體膜的去極化，進而抑制細胞色素C從線粒體釋放到胞質，抑制線粒體凋亡途徑，從而抑制肺動脈平滑肌細胞的凋亡。趙建平等研究發現，大鼠氣道平滑肌細胞的ATP敏感鉀通道的開放導致粒體膜的去極化，線粒體膜電位去極化促進活性氧的增加，活性氧能作為信號分子刺激NF-κB表達增加，進而促進氣道平滑肌細胞增殖。研究 表明，姜黃素能抑制C型Kv1.4鉀通道，減少非洲爪蟾卵母細胞鉀離子的流出。本研究結果顯示，線粒體ATP敏感鉀通道開放劑二氮嗪部分逆轉了姜黃素抑制人子宮肌瘤細胞增殖和誘導細胞凋亡的作用，而ATP敏感鉀通道阻斷劑5-HD沒有影響姜黃素的作用。這表明姜黃素抑制人子宮肌瘤細胞增殖促進其凋亡的機制與姜黃素抑制線粒體ATP敏感鉀通道有關。

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