山苦茶提取物對動脈粥樣硬化大鼠血管內皮功能的影響

　　山苦茶(Mallotus furetianus)是大戟科野桐屬植物，產于海南各地，具有清熱解毒、利膽消食等功效［1］。山苦茶可以促進膽汁的合成和排泄，有助于膽石的排除，對膽道疾病的患者取得較好的臨床效果［2］，動物實驗證明，山苦茶組分B、D具有顯著的利膽作用［3］。動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是以高脂血癥、脂質代謝紊亂，引起脂質過氧化，損傷動脈內皮細胞，形成粥樣斑塊為特征的疾病。本文研究山苦茶組分B、D對動脈粥樣硬化大鼠血管內皮功能的影響及可能的機制。

　　1 材料與方法

　　1.1 動物

　　健康雄性Wistar大鼠90只，體重200～300g，由長春高新醫學動物實驗研究中心提供，合格證號：SCXK-(吉)2003-0004。

　　1.2 藥品與試劑

　　山苦茶葉中兩種不同的提取部位B和D，由海南醫學院化學教研室提供。二苯代苦味肼基自由基（DPPH）（Fluka公司）；無水乙醇（分析純，廣州試劑廠）；羧甲基纖維素鈉（上海黃河制藥廠）；膽固醇（北京化學試劑公司）；豬膽鹽（北京化學試劑公司）；它巴唑（上海復星朝暉藥業有限公司）；維生素 D3（上海通用藥業股份有限公司）；維生素 E（上海金伴藥業有限公司）；苯腎上腺素（PHE）（上海禾豐制藥有限公司）；乙酰膽堿（ACh）（上海試劑三廠）；過氧化物歧化酶（SOD）測定試劑盒、一氧化氮合酶（NOS）測定試劑盒、丙二醛（MDA）測定試劑盒由南京建成生物工程研究所第一分所提供。

　　1.3 儀器

　　721分光光度計（上海第三儀器分析儀器廠）；LXJ-Ⅱ型高速離心機（上海醫用分析儀器廠）；HANGPING FA1104電子分析天平：上海天平儀器廠；電熱恒溫水浴鍋：上海醫療器械五廠；BL-420生物機能實驗系統、HW-400S恒溫平滑肌浴槽：成都泰盟科技有限公司。

　　1.4 方法

　　1.4.1 山苦茶不同組分清除自由基測試［4,5］

　　將DPPH以無水乙醇為溶劑配制為6×10-4mol/L的儲液，放置于4℃冰箱，臨用前用同一溶劑將其稀釋為6×10-5mol/L待用。將山苦茶B、D及維生素C以無水乙醇為溶劑分別配成150、25和0.04g/L，然后將B、D梯度稀釋為0.5、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.005和0.001g/L，將維生素C梯度稀釋為0.04、0.02、0.01和0.005g/L，取上述各組分0.5ml，與2.5ml DDPH反應，反應總體積3.0ml，于1cm比色杯中，517nm處測吸光度，每一吸光度平行測3次，取平均值，計算自由基清除率及自由基清除率為50％時各組分的濃度，即EC50。表1 DDPH加樣表（略）

　　清除率％＝（1-Ai-AjA0）×100％

　　1.4.2 山苦茶不同組分對動脈粥樣硬化大鼠抗氧化能力及血管內皮功能的影響

　　將大鼠隨機分為正常對照組、模型組、維生素E(0.20g/kg)、山苦茶B高劑量組0.081g/kg、山苦茶B低劑量組0.026g/kg和山苦茶D 0.057g/kg。各藥物均以0.5％羧甲基纖維素鈉為溶劑配制。除正常對照組外，其余各組給予高脂飼料飼養，同時灌胃給予相應的藥物，給藥容積為10ml/kg體重；正常對照組和模型組給予相應體積的0.5％羧甲基纖維素鈉。取Wistar大鼠90只，適應性喂養1周后，隨機抽取15只作為正常對照組，普通飼料(長春高新醫學動物實驗研究中心提供)喂養，飲自來水；其余各組大鼠一次性腹腔注射VD370萬U/kg，高脂飼料(2%膽固醇＋0.5%豬膽鹽＋0.2%它巴唑＋5%白糖＋10%豬油＋82.3%普通飼料)飼養9周（在楊彭遠等［6］基礎上有所改變），飲用自來水。

　　1.4.3 抗氧化能力測定

　　給藥9周末，各組大鼠以戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，經頸總動脈插管取血。1 000rpm離心15min，取上清。黃嘌呤氧化法測定SOD活性；硫酸巴比妥比色法測定MDA；化學比色法測NOS；具體操作按南京建成試劑盒要求進行。

　　1.4.4 內皮依賴性血管舒張實驗［7］

　　大鼠采血后，迅速取出胸主動脈，制成寬3mm的胸主動脈環，保留血管內膜，置于通0.95 O2+0.05 CO2混合氣體、pH7.4 的正常Krebs 液的浴槽中。此液配制為(mmol/L)：NaCl 115.0；KCl 4.6；MgSO4 1.16；NaH2PO4 1.16；NaHCO3 21.9；CaCl2 2.5；葡萄糖11.0。標本負荷2.0g，平衡2h，每20min 換營養液1次。在采集資料前,主動脈環用60mmol/L KCl 液每隔20min 收縮一次,直至標本收縮反應可重現。用1μmol/L PHE收縮標本，待收縮達坪值后，按累積濃度法加入ACh，記錄ACh 每一累積濃度時血管舒張效應，以PHE 引起收縮的松弛率表示ACh的血管舒張效應。

　　1.4.5 統計學處理

　　結果以x±s表示，采用SPSS10.0統計軟件包進行單因素方差分析，計量資料采用組間t檢驗(方差不齊時用t’檢驗)。

　　2 結果

　　2.1 山苦茶各組分對DPPH自由基清除能力的比較

　　山苦茶各組分對DPPH自由基清除EC50的比較：山苦茶B >維生素 C >山苦茶D。具體見表2。表2 山苦茶B、D清除DDPH能力與維生素C比較的t值組別EC50（略）

　　2.2 山苦茶各組分對動脈粥樣硬化大鼠抗氧化能力的影響

　　模型組大鼠SOD、NOS較正常組明顯降低（P＜0.01）；MDA較正常組明顯增加（P＜0.05）；山苦茶B、山苦茶D、維生素 E均能明顯增加動脈粥樣硬化大鼠的SOD、NOS活性，降低MDA。其中，山苦茶D對SOD、MDA影響最為顯著，山苦茶B 低劑量對NOS的影響最為顯著，具體見表3。表3 山苦茶各組分對動脈粥樣硬化大鼠抗氧化能力的影響(略)注：與模型組比較,P＜0.05,P＜0.01；與正常組比較,△P＜0.05,△△P＜0.01。

　　2.3 山苦茶各組分對動脈粥樣硬化大鼠內皮依賴性血管舒張實驗的影響

　　模型組大鼠對ACh引起的內皮依賴性血管松弛作用明顯降低，山苦茶B、山苦茶D、維生素E均能改善動脈粥樣大鼠ACh引起的內皮依賴性血管松弛作用，其中，以山苦茶D的作用最為顯著，具體見表4。表4 山苦茶各組分對Ach引起的內皮依賴性松弛作用(略)

　　3 討論

　　以動脈粥樣硬化（AS）為病理基礎的心腦血管疾病是當今發病率和病死率最高的疾病，Ross［8］于1999年在其“損傷反應學說”基礎上提出，AS是一種炎癥反應性疾病，其病理表現為變質、滲出、增生。高血壓、高血糖、高脂血癥、脂質過氧化都是AS炎癥的誘發因素。近年來，氧化低密度脂蛋白（OX-LDL）與動脈粥樣硬化的關系越來越受到人們的關注。高脂血癥引起脂質代謝紊亂，LDL增多，LDL的氧化產物OX-LDL增多。OX-LDL損傷動脈內皮細胞，使內皮細胞對LDL的通透性增加，胞漿發生空泡變性,漿膜皺縮,甚至可使細胞最終壞死。自由基清除實驗表明，山苦茶組分B、D均有清除自由基的作用，其清除自由基能力：山苦茶D>維生素C>山苦茶B。山苦茶組分B、D能明顯降低動脈粥樣硬化大鼠的脂質過氧化產物，提高抗氧化能力，山苦茶B在低劑量即能發揮抗氧化作用，其抗氧化能力并不隨劑量的增加而提高。山苦茶D抗氧化能力強于山苦茶B，這與自由基清除實驗結果一致。山苦茶B、D均能增加NOS活性，增加NO的生成，改善動脈粥樣硬化大鼠的血管內皮功能。山苦茶組分B、D通過清除自由基，降低脂質過氧化產物，提高動脈粥樣硬化大鼠的抗氧化能力，降低動脈內皮細胞的脂質過氧化損傷，減輕AS的炎癥反應，改善血管的舒張能力。同時，山苦茶B、D通過增加動脈粥樣硬化大鼠的NOS活性，增加血管內皮細胞NO的生成，改善ACh引起的內皮依賴性血管舒張作用。

　　總之，山苦茶提取物B、D均能夠改善動脈粥樣硬化大鼠的內皮依賴型血管舒張，這可能與其增強NOS的活性、清除自由基、提高動脈粥樣硬化大鼠的抗氧化能力有關。（參考文獻：山苦茶提取物對動脈粥樣硬化大鼠血管內皮功能的影響，劉月麗，中國熱帶醫學雜志2008年第8卷第3期 ）

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