脂康調(diào)節(jié)高脂血癥家兔肝臟LDL-R mRNA水平的實(shí)驗(yàn)研究

　　高血脂能導(dǎo)致冠狀血管等全身血管的不同程度硬化，導(dǎo)致各種臨床并發(fā)癥。目前治療血脂異常、動(dòng)脈硬化的西藥雖然在臨床取得了一定的療效，但同時(shí)其對(duì)肝、腎功能會(huì)產(chǎn)生一定的影響，不利于長期服用。研制毒副作用小，療效顯著、具有多靶點(diǎn)綜合治療效應(yīng)的中藥復(fù)方制劑，是目前中醫(yī)臨床研究的一個(gè)熱點(diǎn)。中藥脂康由黃芪、沙棘、山楂、紅花、丹參、三七粉等組成，具有健脾益氣、祛痰降濁、調(diào)整陰陽氣血和臟腑功能、活血化瘀之功效，適用于高脂血癥及輕中型冠心病，在臨床上應(yīng)用數(shù)年，對(duì)高脂血癥及動(dòng)脈硬化的防治上已取得了很好的療效。脂康通過清除人體內(nèi)的痰濁、瘀血等有害物質(zhì)，抑制脂質(zhì)合成，促進(jìn)脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和清除，加速脂質(zhì)排泄等多種途徑調(diào)節(jié)血脂。本實(shí)驗(yàn)主要從基因水平上研究脂康對(duì)高脂血癥家兔肝臟低密度脂蛋白受體基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，從而探討脂康調(diào)節(jié)血脂的主要機(jī)理。

　　1 材料與方法

　　1.1 脂康方藥的制備 本處方由沙棘、山楂、丹參、紅花、黃芪、三七等為主組成。經(jīng)醇提、水提、干燥后制成丸劑，每丸0.5g。等臨床劑量按人和動(dòng)物體表面積換算，相當(dāng)于60kg體重人每日的藥量。

　　1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模及用藥方法 純種新西蘭大耳白兔60 只，體重1.9～2.1kg,兔齡4個(gè)月，隨機(jī)選取10只為正常組，喂飼普通顆粒飼料，150g／d，其余50只給予高脂飼料（1％膽固醇、5％蛋黃粉、5％豬油、89％普通飼料）喂飼，150g／d 。于第4周末根據(jù)膽固醇情況隨機(jī)分為5組，每組 10只：模型對(duì)照組給予高脂飼料喂飼，150g/d；其余用藥組除給予高脂飼料喂飼150g/d外，脂康低劑量組給予脂康浸膏0.2 g /（kg·d）；脂康高劑量組給予脂康浸膏0.4 g /（kg·d）；血脂康對(duì)照組給予血脂康0.1g/（kg·d）；辛伐他汀對(duì)照組給予辛伐他汀0.8mg/ （kg·d）。

　　喂飼8周后，麻醉，心臟取血，用于血脂項(xiàng)目檢測(cè)。取靠近肝門靜脈處的肝臟組織，直徑約2cm，用濃度10％福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，HE染色，用光鏡觀察。另取肝臟組織，直徑約1cm，用濃度4%的多聚甲醛固定后做LDL-R mRNA（原位雜交）檢測(cè)。

　　1.3 生化指標(biāo)檢測(cè) 分別于用藥前取耳緣靜脈血及用藥后心臟取血10ml，離心3000r/min，10min，取血清分裝，－20℃冰箱保存，血清總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)及高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量測(cè)定采用酶法，根據(jù)Friedward公式法計(jì)算低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，即LDL-C=TC-（TG/2.2+HDL-C)。動(dòng)脈硬化指數(shù)（AIP）為TG與HDL-C摩爾濃度比值的對(duì)數(shù)。血脂檢測(cè)試劑盒（北京中生生物工程高技術(shù)公司生產(chǎn)）。

　　1.4 肝臟組織LDL-R mRNA原位雜交檢測(cè) （LDLR ISH 原位雜交試劑盒:武漢博士德生物工程有限公司提供）。

　　1.4．1 實(shí)驗(yàn)步驟 (1)將新鮮的肝組織切成不超過4mm的小塊，并及時(shí)用固定液固定1h。(2)常規(guī)脫水、浸蠟、包埋，切片厚度為6～8μm。(3)石蠟切片經(jīng)常規(guī)二甲苯、乙醇脫蠟，滴加H202，室溫5～10min以滅活內(nèi)源性酶。(4)暴露mRNA核酸片段:切片上加3%檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶。37℃ 12～15min，清洗。(5)后固定:胃蛋白酶消化后在玻片上滴加固定液室溫固定10min，清洗3次。(6)預(yù)雜交:首先將濕盒準(zhǔn)備好，每張切片滴加20μl預(yù)雜交液，放入濕盒內(nèi)， 38℃～42℃ 4h，甩去多余的液體。(7)雜交:在每張玻片上滴加20μl雜交液，將原位雜交專用蓋玻片的保護(hù)膜揭開后，蓋在切片上。放恒溫箱雜交過夜。(8)雜交后洗滌。 (9)滴加封閉液:放入37℃ 30min后取出，甩去多余液體，不洗。(10)滴加生物素化鼠抗地高辛:放入37℃ 60min，PBS洗滌。(11)滴加SABC:放入37℃ 30min， PBS洗滌。(12)滴加生物素化過氧化物酶:37℃恒溫箱中放置30min，PBS洗滌。(13)DAB顯色:使用DAB顯色試劑盒，滴至玻片上，顯色30～50min，充分水洗，蘇木素復(fù)染，充分水洗，酒精脫水，二甲苯透明，封片。

　　1.4．2 原位雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定 光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn):原位雜交結(jié)果以細(xì)胞漿內(nèi)或核膜上出現(xiàn)棕黃色顆粒者或斑片為陽性細(xì)胞。

　　1.4．3 分析方法和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)算機(jī)圖像分析，在圖像卡IBM586和Olympus BX60顯微鏡組成的圖像處理系統(tǒng)上，測(cè)定陽性細(xì)胞數(shù):每組每只大鼠各5個(gè)高倍視野(10×40)下原位雜交陽性細(xì)胞率(%)。

　　1.5 結(jié)果統(tǒng)計(jì) 計(jì)量資料采用單因素方差分析，F(xiàn)檢驗(yàn)，結(jié)果用均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

　　2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

　　2.1 血脂水平變化 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示脂康高劑量組對(duì)高脂血癥家兔血清TC、TG、LDL-C水平有顯著的降低作用（P<0.01），對(duì)HDL-C有顯著升高作用（P<0.01）。脂康高劑量與西藥辛伐他汀比較，在降低家兔血清TC、TG、LDL-C的作用相近，升高HDL-C作用優(yōu)于辛伐他汀；與中藥血脂康比較，在降低家兔血清TC、LDL-C的作用明顯優(yōu)于血脂康，降低TG水平作用相近，升高HDL-C水平作用優(yōu)于血脂康。

　　2.2 肝臟LDL-R mRNA水平變化 肝臟LDL-R mRNA的陽性表達(dá)信號(hào)可見細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)計(jì)算各組的陽性表達(dá)率，結(jié)果見表1。

　　正常對(duì)照組與模型對(duì)照組、脂康高劑量組及辛伐他汀對(duì)照組比較差異有顯著性(P<0.01),模型對(duì)照組明顯低于其他各組，比較差異有顯著性(P<0.01), 脂康高劑量組明顯高于其余各組。

　　表1 肝臟LDL-R mRNA水平變化 (略)

　　3 討論

　　本研究利用核酸原位雜交法觀察脂康對(duì)高脂血癥兔肝細(xì)胞LDL-R基因表達(dá)的影響。研究結(jié)果表明，模型組高膽固醇兔肝細(xì)胞LDL-R mRNA表達(dá)水平與正常組相比明顯降低，而當(dāng)高膽固醇兔給予脂康和相關(guān)藥物后，其肝細(xì)胞的LDL-R mRNA表達(dá)水平又明顯提高，尤其是高劑量脂康組最為明顯。可見，脂康有顯著激發(fā)、上調(diào)高血脂兔肝臟細(xì)胞LDL-R基因表達(dá)的效應(yīng)，從分子水平上能有效地調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝作用。

　　近年來，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)LDL受體的功能從生化、免疫、遺傳等方面做了大量研究，認(rèn)為血漿中2/3以上的LDL是通過肝臟LDL受體途徑降解的，其基因表達(dá)異常可影響LDL的清除，使血中LDL水平升高，導(dǎo)致高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化［1］。正常情況下，細(xì)胞LDL受體的數(shù)量決定血循環(huán)中LDL被清除的速度。細(xì)胞內(nèi)含膽固醇含量的多少反饋地控制著LDL受體的合成［2］。當(dāng)細(xì)胞處于高膽固醇負(fù)荷時(shí)，可下行抑制LDL-R基因的轉(zhuǎn)錄，使其表達(dá)下降，LDL-R數(shù)目減少［3］。反之亦然。細(xì)胞漿中的游離膽固醇及其氧化產(chǎn)物（如7-羥膽固醇、25-羥膽固醇）通過調(diào)控LDL受體基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)LDL-R合成，進(jìn)而影響細(xì)胞攝取LDL，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇及其氧化產(chǎn)物含量增高時(shí)，LDL-R基因轉(zhuǎn)錄水平下降，抑制細(xì)胞LDL-R蛋白質(zhì)的合成，細(xì)胞膜LDL-R的數(shù)量下降，減少細(xì)胞對(duì)LDL的進(jìn)一步攝取。反之，則LDL-R基因反饋性轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，細(xì)胞合成LDL受體增加，促進(jìn)細(xì)胞攝取LDL，促進(jìn)膽固醇的攝入［4］。

　　脂康提高LDL-R基因表達(dá)的可能機(jī)理是：AS的病理基礎(chǔ)主要是肝脾失調(diào)，而痰瘀是其病變之標(biāo)，脂康通過理脾，增強(qiáng)了脾的主動(dòng)運(yùn)化功能，而脾的正常運(yùn)化、升清降濁又促進(jìn)了肝的正常疏泄。因此在治療時(shí)以調(diào)脾為主同時(shí)注意調(diào)肝、疏肝，從整體上改善了機(jī)體代謝環(huán)境，加強(qiáng)了機(jī)體代謝機(jī)能，顯著降低了血清TC、LDL-C水平。LDL-R基因啟動(dòng)子5’區(qū)域存在著膽固醇調(diào)節(jié)單位I( sterol regulatory ele ment I,SRE-I)［5］，當(dāng)細(xì)胞膽固醇降低時(shí)可促進(jìn)LDL-R基因表達(dá)，為激活肝臟細(xì)胞膜LDL-R基因表達(dá)創(chuàng)造了條件。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，治療組肝臟細(xì)胞的LDL-R基因表達(dá)強(qiáng)度顯著高于正常組，可能是在LDL-R基因表達(dá)的抑制解除后，LDL-R的活性大大增強(qiáng)，清除了LDL-C，又不斷促進(jìn)LDL-R基因表達(dá)，加速了脂蛋白的分解。由于LDL-R的這種降解作用，使血中LDL-C更趨減少，從而使脂蛋白的代謝進(jìn)入了良性循環(huán)。由于基因水平這一調(diào)控機(jī)制的存在，使細(xì)胞能夠保持膽固醇的精巧平衡。（參考來源：脂康調(diào)節(jié)高脂血癥家兔肝臟LDL-R mRNA水平的實(shí)驗(yàn)研究，李曦明，中華醫(yī)學(xué)研究雜志2007年第7卷第3期）

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