膠質瘤干祖細胞可誘導宿主腦膠質細胞癌變

　　腫瘤微環境在腫瘤發生和發展過程中所起的作用越來越受到關注。在膠質瘤組織中，除了腫瘤細胞，還包括血管內皮細胞、小膠質細胞、免疫細胞和神經干細胞及其分泌的細胞因子等，統稱為腫瘤微環境。腫瘤細胞與腫瘤微環境之間的關系十分復雜，在雙色熒光蛋白示蹤的可移植性腫瘤模型中，因腫瘤細胞與腫瘤微環境細胞顏色不同而易于辨別兩組的相互作用關系。我們利用此模型進行的前期研究表明，膠質瘤干祖細胞在腫瘤組織重構中可融合宿主細胞，轉分化生成腫瘤血管。在本研究中，我們仍然利用此模型，觀察了膠質瘤干祖細胞可誘導宿主膠質細胞癌變。

　　材料與方法
　　一、材料
　　1．細胞株和實驗動物：膠質瘤干細胞SU3和NC-CB57/6J-GFP裸小鼠均又課題組自建。

　　2. 主要試劑：紅色熒光蛋白（red fluorescence protein，RFP）轉基因試劑盒購自上海吉凱基因化學技術有限公司，小鼠抗2′、3′-環腺苷酸-3′-磷酸二酯酶（CNP）單克隆抗體和免抗Nestin多克隆抗體為英國Abcam公司產品，小鼠抗膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）單克隆抗體為美國BD公司產品，Alexa Fluor 555（紅色熒光）標記閃耀抗小鼠IgG（H＋L）和Alexa Fluor 555（紅色熒光）山羊抗兔IgG（H＋L）購于上海碧云天公司。DMEM/F12培養基購自美國Cibco公司，胎牛血清為美國Hyclone公司產品。

　　3. 主要儀器：多模式活體成像儀為KODAK公司產品，告訴分選流式細胞儀及普通流式細胞儀為Beckman公司產品，熒光倒置顯微鏡Carl Zeiss公司產品，小鼠立體定位儀、二氧化碳培養箱及酶標儀均為國產。

　　二、實驗方法
　　1. 建立腫瘤模型：按傳染試劑盒操作手冊，經慢病毒載體將RFP基因穩定傳染于SU3細胞。經過篩選得到高表達RFP的SU3細胞（SU3-RFP細胞 ）。收集SU3-RFP細胞25µl（1×106個），以立體定向技術，經顯微磨鉆磨除的盧骨微骨孔直接穿刺，注入6周齡綠色熒光蛋白（green fluorescence protein，GFP）裸小鼠的右尾狀核。按SPF級管理要求飼養于小鼠獨立送風籠內。接種后1個月左右，荷瘤鼠出現肢體活動障礙、抽搐和消瘦等臨床癥狀時，以Kodak熒光儀行荷瘤鼠活體腦攝影。然后處死裸鼠，行全腦解剖，取腫瘤組織做冰凍切片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

　　2. 被SU3誘變細胞的克隆：取腫瘤組織，剪碎，0.25%胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液，于含10%的胎牛血清的DMEM/F12培養基中傳代培養。以高速分選流式細胞儀分選，收集發綠色熒光的細胞103~104個，接種于6孔培養板中培養，觀察細胞集落的形成情況。為進一步純化細胞來源，以顯微虹吸法吸取單個細胞，接種于96個孔培養板內，從其中10個培養孔中克隆得到具極強無限增值能力的細胞，命名為SU3誘導的宿主腦癌變細胞（SU3-induced host brain tumor cells，SU3-ihBTC）。挑選其中具無限增值能力、穩定表達Nestin和CNP蛋白的2個亞株，分別命名為SU3-ihBTC-H9（H9），液氮凍存備用。

　　3. H1和H9細胞的體外生長特征檢測：棟存細胞復蘇后，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基培養于96孔板，在熒光倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。將生長于蓋玻片上的細胞按試劑說明書進行Nestin、GFAP和CNP免疫組化染色。
　　細胞生長曲線測定：調整細胞濃度為1×104個/ml，按每孔100µl加入96孔板中，設6個復孔，15個時相點，每24小時測定1個時相點的吸光度（A），根據各時間點的A值繪制生長曲線。
　　細胞集落形成率測定：取對數生長期細胞，0.25%胰蛋白酶消化后，按每孔100個細胞接種于6孔板，每種細胞設3個復孔。培養過夜后，計數每種細胞的貼壁細胞數，繼續培養6~8d。磷酸鹽緩沖液洗2遍，甲醇固定10min，棄去固定液，結晶紫染色20min ，自來水緩慢沖去染液，干燥，光鏡下計數細胞集落數（≧50個細胞為1個集落）。
　　Transwell侵襲實驗：將H1、H9和SU-3細胞以無血清DMEM/F12培養液調整細胞濃度為3×105個/ml，按150µl/孔接種于24孔板（美國Costar公司）上室中。上室預涂8µm厚的Matrigel（美國BD Bioscience公司）。下室加入含10%FBS的DMEM/F12完全培養基650µl，培養48h（此時細胞尚未突破小室底部的生物膜），用棉簽擦去生物膠上層尚未侵入生物膜的細胞，參照文獻的方法計數3株細胞侵入小室底部生物膜中的細胞數，評估3株細胞的侵襲能力。每株細胞設3個復孔，分別計數10個視野下的細胞數。

　　4. H1和H9細胞分子分子遺傳學檢測：取培養瓶內處于對數生長期的細胞，在流式細胞儀上測定細胞DNA量。對被檢細胞進行染色體顯帶分析和性別鑒定，同時以免疫細胞化學方法檢測GFAP、CNP和Nestin等細胞特異性分子標志蛋白的表達。

　　5. H1和H9細胞的致瘤實驗：收集體外培養的H1細胞1×106個（150µl），接種于10只裸小鼠右腋下。收集體外培養的H9細胞1×106個（25µl），接種于5只裸小鼠盧內。觀察兩組小鼠的致瘤率，并在接種腫瘤細胞40d后處死裸小鼠，對腫瘤組織行病理學檢測。

　　三、統計學方法
　　采用SPSS 17.0軟件進行統計分析。計量資料以x±s表示，兩組間均數比較采用t檢驗，檢驗水準α=0.05.

　　結果
　　移植瘤模型特征：SU3-RFP細胞穩定高表達RFP。SU3-RFP細胞接種于表達GFP的裸小鼠腦內1個月左右，荷瘤鼠出現后肢功能障礙、消瘦、陣發性四肢抽搐等較為典型的中樞神經受損癥狀。Kodak多功能活體成像顯示，發紅色熒光的腫瘤位于發綠色熒光的小鼠盧內。激光共聚焦顯微鏡下可見，宿主成分因表達GFP而為綠色，腫瘤成分因表達RFP而為紅色，清晰顯示了腫瘤細胞與宿主細胞之間相互交織在一起的復雜關系。

　　再培養細胞的熒光示蹤效果：移植瘤細胞經過再培養，具有增殖能力的細胞呈貼壁生長。在熒光相差顯微鏡下，發出不同熒光的3類細胞清晰可辨：（1）發紅色熒光的SU3-RFP子代細胞，簡稱GFP細胞；（2）發綠色熒光的宿主細胞，為RFP與GFP融合細胞，簡稱RFP/GFP細胞。流式細胞儀檢測RFP、GFP和RFP/GFP細胞的比例分別為（88.99±1.46）%、（5.59±1.00）%和（4.11±1.02）%。

　　GFP細胞的亞克隆：分選獲得的GFP細胞培養7~10d后，形成大量獨立的細胞集落。取單個細胞培養后，獲得了具有無限增殖能力、穩定表達Nestin和CNP蛋白的H1和H9兩個亞株。兩株細胞的形態均以棱形為主，兼有多角形和星形，H9細胞的GFP有關強度明顯弱于H1細胞，CNP的蛋白表達反而強，Nestin則在兩株細胞中均呈陽性表達。

　　H1和H9細胞的體外生長特征：H1和H9細胞在體外均可以長期傳代，表現出無限增殖的特征。細胞生長曲線顯示。細胞集落形成實驗顯示，H1和H9細胞的集落形成率分別為44.4%和20.2%，H1細胞的克隆集落形成能力明顯強于H9細胞。Transwell侵蝕實驗中，SU3細胞侵入小室底部生物膜的細胞數量明顯多于H1和H9細胞侵入小室底部生物膜的細胞數分別為：259.6±23.3和139.9±30.2，H1細胞的侵蝕能力明顯強于H9細胞（P=0.0052），但而二者均低于用于誘導癌變的SU3細胞，其侵入小室底部生物膜的細胞為690.4±102.5（H1細胞與SU3細胞比較，P=0.0017；H9細胞與SU3細胞比較，P=0.0020）.

　　H1和H9細胞的遺傳性特征：流式細胞儀檢測結果顯示，以正常淋巴細胞二倍體為正常對照，H1和H9細胞的DNA合成能力均很強，為超四倍體。染色體G顯帶表明，H1細胞染色體主流為80條左右，H9細胞染色體主流為102條左右，均為端著絲粒，符合鼠源細胞染色體特征，并均為異倍體。熒光原位雜交技術（florescence in-situ hybridization，FISH）性別檢測結果顯示，用于接種的SU3-RFP細胞為XY型，源于男性患者，而被誘變成癌細胞的H1和H9細胞為XY型，源于雌鼠。

　　H1和H9細胞的致癌率：H1細胞皮下接種裸小鼠后，表現出極強的增殖能力，平均20d左右，裸小鼠腫瘤直徑可超過1cm，致瘤率達100%（10/10）。移植瘤組織切片光鏡下可見，腫瘤細胞密集排列，有大量纖維細胞交織存在。H9細胞接種到裸小鼠盧內，40d左右裸小鼠出現神經癥狀，致癌率達到100%（5/5）。移植癌組織切片光鏡下可見，腫瘤細胞密集排列，異形明顯，并廣泛侵襲腫瘤周圍的正常腦組織。

　　討論
　　表達GFP的親鼠首先于美國Jackson實驗室培育成功，以原核注射方式導入線性化的加強型GFP（eGFP）載體于受體鼠受精卵，獲得表達GFP的成年鼠，再與C57BL/6J小鼠回交，建立了穩定表達GFP的C57BL/6J小鼠。本實驗用的C57BL/6J GFP熒光小鼠從南京大學購得，NC-C57BL/6J裸小鼠是由蘇州大學附屬第二醫院神經外科實驗室的NC系裸小鼠（♂）與C57BL/6J小鼠（♀）雜交而成，全身穩定表達GFP（毛發和紅細胞除外）。這種GFP具有如下優點：（1）性質穩定：即使在甲醛固定的標本中，熒光仍然保持穩定。-70℃冰箱保持6周以上熒光不受影響。（2）無毒性：分子量小。相對分子質量為25000~30000，對受體細胞基本無毒性。（3）便于實時定位觀察：GFP使用方便，可行活細胞實時定位觀察。

　　有關有關蛋白在腫瘤領域的示蹤研究剛剛起步。Yang等將GFP分別轉染于胰腺、肺和乳腺等腫瘤細胞，并原位移植至裸鼠體內，獲得了裸鼠全身癌灶的影像。Hoffman將傳染U87-RFP的膠 質癌細胞原位移植于表達GFP的裸小鼠，在體內活動觀察了移植瘤的生長狀況。Farin等將標本有eGFP和DsRed-2的C6細胞注入到新生鼠的前腦，連續觀察了C6在腦中不同時期的遷移和增殖。我們課題組將入腦膠質瘤干祖細胞SU2接種于自行培育的NC-C57BL6/J裸小鼠腦內，發現了腫瘤細胞與宿主細胞的融合；也觀察到膠質瘤干祖細胞在移植瘤組織重構中起著重要的作用，并參與腫瘤血管擬態的形成。Zhou等采用類似的實驗模型，開展了人腦膠質瘤SHG44的移植實驗。在本研究中，我們在自建的SU3-RFP/GFP腦腫瘤模型中，采用雙色熒光示蹤技術，發現只有宿主才有的腦腺GFP細胞誘導成癌細胞，這一發現對進一步研究腫瘤微環境組成成員的相生相克關系有主要意義。

　　間質細胞及其分泌的因子是組成腫瘤微環境的主體，其余腫瘤細胞的關系，在潛伏（隱匿）期以相克為主，在進展期以相生為主。后者是指間質細胞（如免疫炎癥細胞中的白細胞、淋巴細胞和巨噬細胞等機制固有免疫細胞）不再起監視作用，而起促進腫瘤生長的作用。本研究結果顯示，宿主腦組織中廣泛存在神經膠質細胞，在移植的腫瘤細胞重構過程中被的誘導癌變了。從微生態角度考慮，癌變神經膠質細胞屬于組成腫瘤微環境的成員之一，有可能在腫瘤惡性進展過程中起著重要的作用，但這種變化在臨床上是難以發現的，因為癌變的起始細胞和誘導癌變的細胞都是膠質細胞。我們用RFP和GFP分別示蹤接種的外源細胞和原本存在的宿主細胞，結果顯示，代表宿主的GFP細胞癌變了。神經膠質細胞特征細胞特異性標志蛋白檢測結果為Nestin陽性、CNP陽性、GFAP陽性，表明H1和H9細胞是癌性少突細胞，這與Liu等的報道的少突前體細胞易癌變現象相符。

　　鑒于宿主細胞被接種的腫瘤細胞誘導癌變是新的發現，對癌變細胞的鑒定必須充分。本實驗結果提示如下3個方面的證據：（1）在培養液中貼壁生長的細胞能無限制傳代、細胞間生長接觸抑制消失、高集落形成率、在Transwell膜上的高穿過率、在細胞增殖曲線上反映的高增殖速度和DNA合成能力上表現為異倍體等癌細胞表型；（2）移植裸小鼠100%的致癌率和腫瘤組織病理學符合惡性腫瘤的特征；（3）細胞表達GFP、染色體端著絲粒和FISH的性別鑒定結果，都能證明癌變的兩株細胞為鼠源性，而且由于表達神經膠質細胞特異性標志蛋白，可判定其移植瘤為鼠源性膠質細胞癌。這一新發現對進一步研究腫瘤微生態環境中各成員間的相生相克關系具有重要的意義。（來源：中華腫瘤雜志2013年1月 第35卷 第1期《膠質瘤干祖細胞可誘導宿主腦膠質細胞癌變》陳延明 費喜峰 王愛東 代興亮 張金石 崔寶乾 張全斌 趙耀東 陳驊 王之敏 蘭青 董軍 黃強）

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