西羅莫司對肝癌HepG2細胞中HIF-1α表達影響

【摘要】 目的 研究西羅莫司對氯化鈷（CoCl₂）誘導的肝癌HepG2細胞中缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）表達的影響。方法 用CoCl₂誘導細胞模擬缺氧微環(huán)境，并根據(jù)CoCl₂濃度不同分為0、50、100、200及400 μmol/L組；選擇CoCl₂濃度為200 μmol/L來模擬腫瘤內(nèi)缺氧微環(huán)境，同時分別聯(lián)合0、10、20、30、40 nmol/L的西羅莫司作用于細胞24 h。應用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應檢測HIF-1α mRNA的表達。

    結(jié)果 隨CoCl₂濃度提高，HIF-1α mRNA的表達升高（F=103.67,q=4.83～24.15,P<0.05），其中CoCl₂濃度為200和400 μmol/L兩組比較差異無顯著性（q=0.69,P>0.05）；西羅莫司可使HepG2細胞HIF-1α mRNA的表達降低并呈劑量依賴性（F=127.90,q=4.24～28.28,P<0.05）。

    結(jié)論 缺氧微環(huán)境可以促進HepG2細胞中HIF-1α mRNA的表達，HIF-1α可能通過在細胞缺氧調(diào)控中起作用而參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。西羅莫司可以抑制HIF-1α mRNA的表達，這可能是其抗腫瘤的機制之一。

　　由于腫瘤細胞的失控性生長導致耗氧量的增加，缺氧成為腫瘤細胞生長的基本環(huán)境，腫瘤細胞如何適應這一微環(huán)境并保持持續(xù)生長已成為腫瘤研究的中心問題。缺氧誘導因子-1（HIF-1）是缺氧條件下廣泛存在于哺乳動物和人體內(nèi)的一種轉(zhuǎn)錄因子，由HIF-1α和HIF-1β亞基組成，HIF-1α是惟一的氧調(diào)節(jié)亞單位,決定HIF-1的活性，而HIF-1直接調(diào)控VEGF基因的表達，是惡性腫瘤誘導新生血管形成的主要調(diào)控因子。

    西羅莫司（SRL）是從吸水性鏈霉菌發(fā)酵液中提取出的一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，研究顯示SRL不僅有抗移植免疫排斥反應作用，而且還有廣泛的抗腫瘤作用。本文用氯化鈷（CoCl2）化學模擬誘導肝癌HepG2細胞內(nèi)缺氧，再加不同濃度SRL培養(yǎng)，觀察細胞內(nèi)HIF-1α表達變化，并對其發(fā)生機制進行初步研究。
　　1 材料與方法
　　1.1 材料
    RPMI 1640培養(yǎng)基為美國Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清為美國Gibco公司產(chǎn)品；SRL為Sigma公司產(chǎn)品；Trizol試劑盒購自Introvigen公司；RT-PCR試劑盒購自美國Promege公司；引物及GAPDH內(nèi)參由上海生工生物工程公司提供。
　　1.2 方法
　　1.2.1 細胞培養(yǎng)
　　人肝癌HepG2細胞由南京凱基生物科技有限公司提供。將肝癌HepG2細胞接種于含體積分數(shù)為0.10的胎牛血清的1640培養(yǎng)基,內(nèi)含100 U/L青鏈霉素，在37 ℃、體積分數(shù)為0.05的CO₂、正常氧濃度與飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，進入對數(shù)生長期后，傳代于6孔細胞培養(yǎng)板中，選擇生長良好的肝癌細胞用于實驗。
　　1.2.2 實驗分組
　　對照組用培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，實驗組用培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，用含不同濃度CoCl₂的培養(yǎng)液處理細胞24 h，根據(jù)CoCl₂濃度不同分為5個亞組（0、50、100、200和400 μmol/L組）； 選擇CoCl₂濃度為200 μmol/L來模擬腫瘤內(nèi)缺氧微環(huán)境，用培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞24 h后，對照組用200 μmol/L的CoCl₂培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，實驗組用含SRL分別為0、10、20、30、40 nmol/L的200 μmol/L的CoCl₂培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。
　　1.2.3 RT-PCR
　　TRIZOL法提取6孔板內(nèi)各組細胞的總RNA，紫外線分光光度計測定總RNA濃度，重復測定3次，-70 ℃冰箱保存。

    各樣本取1 μg總RNA，按Promege一步法使用說明書進行RT-PCR；所用引物由上海生物工程技術(shù)有限公司合成：HIF-1α上游引物序列為5′-ACGTGTTATCTGTCGCTTTG-3′,下游引物序列為5′-TAGGTTTCTGCTGCCTTGTAT-3′,目的片段長度為371 bp；內(nèi)參照基因GAPDH的上游引物序列為5′-TCATGGGTGTGAACCATGAGAA-3′，下游引物序列為5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′，目的片段長度為146 bp。

    RT-PCR反應條件：45 ℃逆轉(zhuǎn)錄45 min，94 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s，64 ℃退火1 min，68 ℃延伸2 min，27次循環(huán)后68 ℃終末延伸7 min。取出5 μL PCR 產(chǎn)物，加1 μL Loadingbuffer，反復吸打混勻后，于20 g/L的瓊脂糖凝膠中電泳，電流為10 mA，電源120 V，電泳30 min，長波紫外線下觀察電泳條帶情況并照相，GIS凝膠成像處理系統(tǒng)成像，并進行吸光度定量分析。

    PCR 產(chǎn)物相對量=擴增產(chǎn)物的吸光度值/GAPDH 擴增產(chǎn)物的吸光度值。陽性結(jié)果為HIF-1α的RT-PCR產(chǎn)物電泳后在紫外線燈照射下出現(xiàn)371 bp的熒光條帶。
　　1.2.4 統(tǒng)計學處理
　　采用SPSS 10.0及PPMS 1.5統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，組間比較采用單因素方差分析。
　　2 結(jié) 果
　　2.1 不同劑量CoCl₂對肝癌HepG2細胞中HIF-1α mRNA表達的影響
HIF-1α mRNA在0、50、100、200和400 μmol/L的CoCl₂處理組表達強度分別為0.79±0.04、0.94±0.03、1.06±0.02、1.14±0.02、1.13±0.03，隨著CoCl₂的濃度的升高HIF-1α mRNA表達增強（F=103.67,q=4.83～24.15,P<0.05），其中CoCl2濃度為200和400 μmol/L兩組比較差異無顯著性（q=0.69,P>0.05）。RT-PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果見圖1。
　　2.2 不同劑量的SRL對肝癌HepG2細胞中HIF-1α mRNA表達的影響
HIF-1α mRNA在含SRL分別為0、10、20、30、40 nmol/L的200 μmol/L的CoCl2培養(yǎng)液處理組中的表達強度分別為1.10±0.03、1.04±0.02、0.95±0.03、0.84±0.03、0.70±0.03，隨著SRL濃度的升高HIF-1α mRNA的表達減弱（F=127.90,q=4.24～28.28,P<0.05）。RT-PCR 產(chǎn)物的電泳結(jié)果見圖2。
　　3 討 論
    肝細胞癌惡性程度高,進展迅速,術(shù)后易復發(fā)和轉(zhuǎn)移,目前尚缺乏有效的治療藥物。肝細胞癌為典型的多血管腫瘤,抗血管生成在其治療中有著誘人的前景。缺氧誘導因子HIF-1最先由WANG等在研究低氧誘導的基因表達時發(fā)現(xiàn)，它是在缺氧條件下廣泛存在于人體內(nèi)，由HIF-1α和HIF-1β亞基組成異源二聚體的轉(zhuǎn)錄因子，其中HIF-1α是主要活性單位，其表達受氧分壓調(diào)節(jié)。

    HIF-1α感受缺氧信號后，自身被迅速激活，進入核內(nèi)與其他轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用并結(jié)合到缺氧相關(guān)基因的調(diào)控元件，調(diào)控相關(guān)基因的表達，以維持細胞和機體的氧自穩(wěn)平衡及能量代謝平衡。而缺氧是實質(zhì)性腫瘤物理微環(huán)境之一，所以HIF-1α對于腫瘤的生長尤為重要。鑒于此點，我們選擇HIF-1α為研究指標，探討SRL抗腫瘤作用的可能機制。
    本研究利用在培養(yǎng)液中加入CoC_l2的方法模擬細胞缺氧環(huán)境，這里CoCl₂的作用與低氧一致，Co²⁺是亞鐵螯合酶的底物，可取代細胞中的Fe²⁺與血紅素結(jié)合，使原卟啉Ⅸ與O₂分子的結(jié)合能力下降，阻斷O₂信號的傳遞，導致細胞內(nèi)環(huán)境處于乏氧狀態(tài)，誘導HIF-1α的表達。同時，Co²⁺還能通過替代作為脯氨酰羥化酶（PHD）輔助因子的Fe²⁺，抑制PHD對HIF-1α的羥基化作用，減少HIF-1α的降解。

    本研究結(jié)果顯示，利用低濃度的CoCl₂預處理細胞，HIF-1α的表達隨著缺氧程度的增高而增強，提示無論在常氧還是低氧條件下，HIF-1α在肝癌HepG2細胞均中有表達，且隨著CoCl₂濃度的增高，即缺氧信號的加強（實質(zhì)性腫瘤發(fā)展越快,氧供的不平衡就越明顯），其mRNA表達水平上調(diào)。

    其可能的機制為：當氧需求量絕對或相對增加，腫瘤細胞可通過啟動缺氧應答的開關(guān)“HIF-1”，使其表達上調(diào)，最終啟動一系列下游基因轉(zhuǎn)錄，其產(chǎn)物使腫瘤細胞適應缺氧的應激狀態(tài)繼續(xù)存活和增殖。
    SRL是一種大環(huán)內(nèi)酯類化合物，具有抗真菌和增強免疫抑制活性的作用，目前作為免疫抑制劑廣泛應用于臨床。最近研究結(jié)果顯示，SRL具有廣泛的抗腫瘤作用，如抗胰腺癌、肺癌、胃腸道腫瘤、腎癌等。研究表明，在低氧環(huán)境激活HIF-1α的過程中，mTOR-磷脂酰肌醇-3激酶/抗凋亡蛋白途徑起了進一步放大效應。

    以往研究顯示，抑制mTOR-磷脂酰肌醇-3激酶/抗凋亡蛋白途徑對實體腫瘤，特別是惡性程度高或?qū)�化療耐藥的腫瘤，具有治療意義。SRL通過特異性抑制mTOR而抑制HIF-1α的激活，可有效下調(diào)HIF-1α基因的表達，既能抑制HIF-1α基因的合成，又能增加其降解，并能下調(diào)HIF-1α基因調(diào)控的其他基因的表達。
    本實驗結(jié)果顯示，SRL能明顯使肝癌HepG2細胞HIF-1α mRNA表達下降，且隨著SRL濃度的升高，HIF-1α mRNA的表達也越來越低。由此推測，SRL可以通過上述信號途徑，阻斷HepG2細胞表達HIF-1α mRNA，進而抑制其下游基因VEGF的表達，從而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，這可能是其抗腫瘤的機制之一。
    總之，近年來抗腫瘤血管生成已成為腫瘤治療的基礎(chǔ)和臨床研究熱點，是最有希望的腫瘤導向治療靶標。尤其是研制以HIF-1為治療靶點的腫瘤治療藥物，已成為抗腫瘤治療研究的熱點，通過抑制HIF-1α蛋白表達來抑制受其調(diào)控的多種促腫瘤生長相關(guān)基因的表達水平，從多方面入手抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

    本研究通過對SRL抑制人肝癌HepG2細胞中HIF-1α表達的研究,進一步揭示其抗腫瘤血管生成的作用機制，為開發(fā)抗腫瘤血管生成新藥奠定理論基礎(chǔ)，為臨床應用提供理論依據(jù)。