抗癌藥物的篩選評(píng)價(jià)以及非臨床研究臨床試驗(yàn)的特點(diǎn)介紹

 

     癌癥是當(dāng)今世界上大多數(shù)國家的主要死因之一。盡管到目前為止已有數(shù)十種化療或輔助抗癌藥物可以用于臨床治療，但大多數(shù)藥物只能使病情緩解，無法達(dá)到治愈的目的。雖然一些兒童的癌癥或成人皮膚腫瘤有治愈或長期緩解的可能，但大多數(shù)死亡率很高而又很常見的癌癥如胃癌、食道癌、肺癌等仍缺乏有效的抗癌藥物。近年來，各國都在抗癌藥物的研究與發(fā)展上投入了大量的人力、物力，希望在不久的將來能有所突破。

 

    抗癌藥物研究的分子生物學(xué)基礎(chǔ)

    抗癌藥物研究的依據(jù)是人們對(duì)癌癥生物學(xué)的理解。早期人們對(duì)于癌癥的了解限于細(xì)胞水平，所以大多數(shù)藥物的發(fā)展著眼于細(xì)胞分裂分化和免疫等環(huán)節(jié)。近年來，腫瘤生物學(xué)的進(jìn)展非常迅速，人們對(duì)癌癥的了解深入到了分子水平，比如癌基因的發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡學(xué)說的形成，腫瘤抑制基因的發(fā)現(xiàn)等為抗癌藥物的研究與發(fā)展提供了新的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。以下簡述這些方面的研究進(jìn)展。

 

    一、細(xì)胞分裂

    自50年代，人們認(rèn)為腫瘤細(xì)胞比正常細(xì)胞分裂快，并應(yīng)用這一概念發(fā)展了一系列的抗癌藥物用于干擾或阻止細(xì)胞的分裂。主要包括破壞細(xì)胞脫氧核糖核酸（DNA）以及蛋白質(zhì)代謝的藥物。比如烷化劑（Alkylating   Agents），   DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑（Topoisomerase Inhibitors）以及抗生素類（Antibiotics）。通過對(duì)細(xì)胞周期的仔細(xì)研究，現(xiàn)在我們知道腫瘤細(xì)胞并不比正常細(xì)胞分裂得快，只是在任何時(shí)間都有較高比例的腫瘤細(xì)胞處于分裂期。

 

    二、細(xì)胞增殖周期調(diào)控  

    因?yàn)槟[瘤細(xì)胞失去了正常細(xì)胞的控制機(jī)制，在癌組織中的細(xì)胞更傾向處于細(xì)胞分裂期。根據(jù)這一理論，許多抗癌藥物作用于處于分裂期的細(xì)胞。如抑制DNA合成的抗代謝藥物（Antimetabolites）和抑制微小管有絲分裂形成的微小管蛋白結(jié)合劑（Tubulin—Binding Atents）就是根據(jù)此概念發(fā)展而來的。

 

    三、腫瘤抗原

    研究表明某些癌癥組織在免疫學(xué)上不同于正常細(xì)胞，癌癥細(xì)胞在一定程度上是“異物”，或者是去分化的細(xì)胞，且可能存在特異的腫瘤抗原，這一發(fā)現(xiàn)是腫瘤免疫治療的基礎(chǔ)。根據(jù)這一概念，人們?cè)噲D用各種特異及非特異的方法，提高人體對(duì)腫瘤的免疫功能。比如用細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞、單克隆抗體、細(xì)胞因子（Cytokins）以及核受體結(jié)合劑（VitaminD3 、Retinoids）等治療癌癥。

 

    四、癌基因及其活化

    80年代以來的研究發(fā)現(xiàn)，在某些腫瘤細(xì)胞中，一些癌基因被激活。若能抑制癌基因的激活，應(yīng)可治療癌癥。例如研究發(fā)現(xiàn)ras癌基因蛋白的激活需要farnesyl蛋白轉(zhuǎn)移酶的存在，因此farnesyl蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑被發(fā)展成為抗癌藥物。另外，許多人類腫瘤，如膀胱癌、乳腺癌以及慢性白血病，含有不正常的酪氨酸激酶（Tyrosine Kinase），因此EGF-受體激酶、erb－B2激酶以及abl激酶等一系列酪氨酸激酶抑制劑被用于發(fā)展抗癌藥物。除此以外，調(diào)節(jié)哺乳類細(xì)胞信息傳遞以及細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換的絲氨酸／蘇氨酸激酶也用作發(fā)展抗癌藥物的靶分子。

 

    五、腫瘤抑制基因

    現(xiàn)在已充分證明，在人體中不僅存在癌基因，而且還存在腫瘤抑制基因，如 P53等。在某些人類癌癥細(xì)胞中，腫瘤抑制基因缺失或失去功能，這提供了另一潛在的藥物發(fā)展靶分子。大約有30％～50％的癌癥失去了成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤（Retinoblastoma，Rb）基因及p53蛋白基因。另外AT，MCC，APC，Von Hipel－Lindan蛋白基因的突變也在某些組織中找到。對(duì)于這些突變，可能的潛在治療方法是用基因工程的方法恢復(fù)這些基因的功能。

 

    六、細(xì)胞分化成熟

    對(duì)于哺乳類細(xì)胞來說，每次細(xì)胞分裂都會(huì)失去染色體末端的端粒 DNA（ Telomeric  DNA）。對(duì)于正常細(xì)胞來說，細(xì)胞內(nèi)貯存的端粒DNA足以補(bǔ)充這一丟失。但腫瘤細(xì)胞處于持續(xù)分裂期需要更多的端粒DNA，因此需要端粒酶（Telomerase）來補(bǔ)充失去的端粒DNA，否則腫瘤細(xì)胞不能無限制地分裂。這給抗癌藥物發(fā)展提供了一條新的途徑一使用端粒酶抑制劑。

 

    七、新血管生成

    腫瘤需要新血管的生長才能維持腫瘤的生長。腫瘤細(xì)胞能誘導(dǎo)血管生成及促進(jìn)血流供應(yīng)。假如沒有新的血供，實(shí)體瘤不可能無限生長，直徑不會(huì)超過1～2毫米。因此，若能抑制新血管在腫瘤內(nèi)的生長就能抑制腫瘤的生長。根據(jù)這一理論，80年代以來的許多研究致力于發(fā)展血管生長調(diào)節(jié)物�，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)幾種潛在的靶分子可用于此目的，包括內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF），纖維細(xì)胞生長因子（FGF）。 這些調(diào)節(jié)因子的抗體以及多肽分子抑制劑均可發(fā)展成抗癌藥。目前已有部分在動(dòng)物模型中顯示抗癌治性并進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，比如 TNP～470，  Suramin等。

 

    八、DNA修復(fù)

    正常細(xì)胞存在一套完整的DNA修復(fù)機(jī)制，而腫瘤細(xì)胞一些基因的突變使其失去此功能。這給抗癌藥物的發(fā)展提供了一個(gè)新方向：一是可以用基因工程的方法修復(fù)這些缺陷；二是可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的這類突變，使腫瘤細(xì)胞對(duì)化療更敏感。

 

    九、細(xì)胞凋亡

    自70年代以來，研究發(fā)現(xiàn)許多細(xì)胞組織具有周期性的自我生長調(diào)節(jié)機(jī)制。一些細(xì)胞在組織發(fā)育的一定階段將自然死亡。通常把這種現(xiàn)象稱為細(xì)胞程序化死亡或細(xì)胞調(diào)亡。這一過程涉及到細(xì)胞內(nèi)外的一系列信息傳遞過程。進(jìn)入這一過程的細(xì)胞發(fā)生一系列的特征性形態(tài)學(xué)和生化的變化，以至最終死亡。許多人類疾病據(jù)說與細(xì)胞凋亡的增加或減少有關(guān)。腫瘤細(xì)胞可能失去細(xì)胞凋亡的功能，恢復(fù)這一功能可用于腫瘤治療�，F(xiàn)認(rèn)為大多數(shù)臨床使用的抗癌藥物可引起特定癌癥細(xì)胞的細(xì)胞調(diào)亡。另外，與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)更為敏感。這或許可以解釋作用于細(xì)胞分裂的抗癌藥物為何更易殺死腫瘤細(xì)胞�，F(xiàn)發(fā)現(xiàn)某些癌基因的激活及腫瘤抑制基因的丟失可抑制細(xì)胞凋亡，因此，如能抑制癌基因或修復(fù)腫瘤抑制基因功能或許可以解決某些癌癥對(duì)現(xiàn)有化療藥物不敏感的問題。研究細(xì)胞凋亡是近年來分子生物學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)，許多與細(xì)胞凋亡有關(guān)的信息傳遞、蛋白酶活性的研究可望為腫瘤治療提供更新的手段。

 

    十、腫瘤的抗藥性

    在腫瘤治療中，另一嚴(yán)峻挑戰(zhàn)是抗藥性。許多腫瘤細(xì)胞對(duì)一系列相關(guān)或不相關(guān)的藥物均具有抗藥性。這一領(lǐng)域也是抗癌藥物研究的重點(diǎn)。腫瘤抗藥性可能與減少對(duì)藥物的吸收與攝取、加快藥物的降解代謝、加快藥物從細(xì)胞內(nèi)的排出以及特殊蛋白的表達(dá)有關(guān)。已發(fā)現(xiàn)多種與抗藥性有關(guān)的基因，抑制這些基因的表達(dá)可望達(dá)到提高或恢復(fù)腫瘤組織對(duì)藥物的敏感性。

 

    十一、細(xì)胞信息傳遞

    各種細(xì)胞生長因子、細(xì)胞因子、蛋白激酶等均存在于正常及腫瘤細(xì)胞，但是其活性程度及表達(dá)水平有差異。一般說來，由于與細(xì)胞增殖有關(guān)，這些因子在腫瘤細(xì)胞中的活性較高，或?qū)δ[瘤細(xì)胞的增殖比起正常組織（不分裂）更為必需。因此，調(diào)節(jié)或抑制細(xì)胞信息傳遞系統(tǒng)可能成為新的抗癌藥物的發(fā)展依據(jù)。例如，近年來許多調(diào)節(jié)蛋白激酶C和蛋白激酶A的藥物正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。許多天然藥物也作用于細(xì)胞信息傳遞系統(tǒng)。

 

    十二、聯(lián)合療法

    上述靶分子都可能作為單一藥物的發(fā)展基礎(chǔ)。但是，現(xiàn)在的趨勢是發(fā)展聯(lián)合療法，不僅是多種化療藥物聯(lián)合使用，還包括與生物制劑、放射等療法的聯(lián)合使用。這些聯(lián)合療法的機(jī)制大致包括：各種療法作用于不同的細(xì)胞周期；提高腫瘤細(xì)胞的敏感性；使腫瘤細(xì)胞停留在對(duì)化療敏感的細(xì)胞周期；降低藥物在人體內(nèi)及細(xì)胞內(nèi)的降解速度；提高藥物對(duì)腫瘤組織的針對(duì)性分布及攝取率；提高正常組織對(duì)藥物副作用的抵抗力。

 

 

    化療藥物的篩選與評(píng)價(jià)

    化療藥物的篩選可采用各種不同的方法，但總的來說可歸納為兩大類，一類是按已往經(jīng)驗(yàn)來尋找新藥，另一類則是按腫瘤生物學(xué)和分子生物學(xué)特征來推斷及設(shè)計(jì)新藥。篩選的方法難易程度不等，但關(guān)鍵是這些系統(tǒng)必須能在較短的時(shí)間內(nèi)篩選大量的化合物�；�療藥物篩選的主要目的是找出具有發(fā)展前途的先導(dǎo)化合物，然后對(duì)這些化合物作進(jìn)一步的改進(jìn)使其適用于臨床治療。

    下面將著重討論美國國立癌癥研究所（NCI）現(xiàn)采用的化療藥物篩選方法，并對(duì)其它方法亦作一簡要的介紹。

    一、NCI所用的體外化療藥物篩選法

    簡單地說，NCI的體外化療藥物篩選系統(tǒng)由60種不同的人體腫瘤細(xì)胞株組成，測定每個(gè)受試化合物在一定濃度范圍抑止各腫瘤細(xì)胞的生長的能力或細(xì)胞毒性程度。以常規(guī)采用的篩選試驗(yàn)為例，在實(shí)驗(yàn)開始前一天，所有60種腫瘤細(xì)胞株細(xì)胞先接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，然后將受試化合物10倍梯度稀釋，一般最高濃度采用10－4mol。每種化合物試驗(yàn)5種不同濃度。樣品加入細(xì)胞懸液后培育48小時(shí)。此后用細(xì)胞染色法測定細(xì)胞的生長曲線，用sulforhodamine染色，再測定吸光度用以估計(jì)細(xì)胞數(shù)目。根據(jù)比色結(jié)果畫出60條劑量一反應(yīng)曲線，然后計(jì)算出50％生長抑止?jié)舛龋℅I50），100％生長抑止?jié)舛龋═GI）以及50％細(xì)胞死亡濃度（LC50）。再將各細(xì)胞系的GI50、TGI和LC50匯總畫出均數(shù)圖，從此圖可以大致看出該化合物對(duì)不同的腫瘤細(xì)胞株的抑止能力。然后用計(jì)算機(jī)進(jìn)行計(jì)算、模擬、比較，評(píng)價(jià)受試化合物的特征是否與某一類已知化療藥物類似，從而推測可能存在的抗癌機(jī)制。據(jù)統(tǒng)計(jì)，NCI到目前為止已篩選了近460000種化合物。用NCI體外化療藥物篩選系統(tǒng)得出的數(shù)據(jù)也可用于指導(dǎo)將來對(duì)主要化合物的改造，使化合物的藥理及毒理性質(zhì)更為理想。

 

    二、以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的化療藥物篩選方法

    近年來，對(duì)腫瘤的分子生物學(xué)研究取得了很大的進(jìn)展，這給化療藥物的發(fā)展提供了一些新的目標(biāo)。現(xiàn)在已有許多采用X射線衍射、蛋白結(jié)晶、基因配對(duì)等方法來推斷及設(shè)計(jì)抗癌藥物。這些方法往往開拓了一些全新的途徑，但其缺點(diǎn)是這些化合物不一定對(duì)腫瘤細(xì)胞有選擇性。另外，這些化合物是否能進(jìn)入腫瘤細(xì)胞也是一大問題。因此，任何采用非細(xì)胞系統(tǒng)篩選的化合物都必須經(jīng)過細(xì)胞系統(tǒng)以及合適的動(dòng)物模型的檢定才能進(jìn)入臨床試驗(yàn)。

 

    三、經(jīng)典的化療藥物篩選模型  

    1985年NCI建立體外細(xì)胞篩選系統(tǒng)。在此之前，NCI抗癌藥物的篩選方法主要采用體內(nèi)腫瘤模型來進(jìn)行。將白血病細(xì)胞株L1210及P388植入免疫缺陷鼠體內(nèi)，待腫瘤長成后再給予不同劑量的篩選化合物，然后觀察所試化合物是否能抑制腫瘤細(xì)胞的生長，甚至使腫瘤細(xì)胞死亡、消失。然后再作計(jì)算分析，得出最小抑制劑量、中位抑制劑量、LC50等指標(biāo)；以這些指標(biāo)作為衡量受試化合物的抗癌作用強(qiáng)度。這一方法的優(yōu)點(diǎn)是得到的藥物可穿過細(xì)胞膜以及某些生理屏障，缺點(diǎn)是所得到的藥物僅對(duì)快速分裂的腫瘤（如白血病、淋巴瘤）療效較好，而對(duì)實(shí)體瘤的治療遠(yuǎn)不盡人意。針對(duì)這一問題，  NCI在1985年對(duì)抗癌藥物的篩選過程作了如下重大改變：①利用以腫瘤種類為指導(dǎo)的體外細(xì)胞篩選法取代體內(nèi)篩選法；②利用實(shí)體瘤細(xì)胞株取代白血病細(xì)胞株；③用相對(duì)小量的原始材料用于初篩；④重新強(qiáng)調(diào)利用生物實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)天然物中具抗癌活性成分的篩選。

 

    體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的免疫缺陷鼠腫瘤模型現(xiàn)已不常用于藥物的初篩，而常規(guī)用于對(duì)初篩所得的先導(dǎo)藥物作進(jìn)一步測試以觀察評(píng)估化合物對(duì)不同的實(shí)體瘤的治療作用。