臨床常見腹瀉致病菌的快速鑒定方法研究進(jìn)展

來源：百濟(jì)藥房藥訊作者：百濟(jì)動態(tài) 瀏覽：發(fā)布時間：2014/10/4 8:56:00

　　腹瀉是一種發(fā)病率高并流行于世界各地的胃腸道傳染病,其發(fā)病率僅次于上呼吸道感染[1],在我國,感染性腹瀉發(fā)病率居所有傳染病首位[2]。目前細(xì)菌性腹瀉的初步診斷主要是根據(jù)患者的臨床表現(xiàn)結(jié)合流行病學(xué)依據(jù)和醫(yī)生的經(jīng)驗(yàn),在診斷明確之前使用廣譜抗生素,易導(dǎo)致細(xì)菌耐藥。因此致病菌快速鑒定在疾病的診斷、臨床用藥、疾病控制等方面都有非常重要的意義。臨床常規(guī)鑒定主要根據(jù)細(xì)菌的形態(tài)、染色性、理化性質(zhì)進(jìn)行鑒定,操作繁瑣、耗時、靈敏性及特異性差。新興的分子生物學(xué)和蛋白組學(xué)技術(shù)為快速準(zhǔn)確鑒定臨床常見腹瀉致病菌提供了保證。本文就分子生物學(xué)和蛋白組學(xué)技術(shù)在臨床常見腹瀉致病菌檢測和鑒定中的應(yīng)用進(jìn)行扼要綜述。

　　1 常見腹瀉致病菌常規(guī)分子生物學(xué)檢測方法

　　1.1 常規(guī)

　　PCR技術(shù)是一種特異性擴(kuò)增DNA的體外酶促反應(yīng),用于擴(kuò)增位于兩段已知序列之間的DNA,利用特異DNA序列鑒定細(xì)菌的方法，因其操作安全、簡便快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)受到廣泛重視。李小麗等[3]采用常規(guī)PCR方法從48例腹瀉患者糞便中擴(kuò)增痢疾桿菌侵襲質(zhì)粒基因(ipah)和侵襲相關(guān)基因位點(diǎn)(ial)基因,其基因陽性率分別為100%(48/48)、70.8%(34/48),電泳結(jié)果顯示擴(kuò)增到的ipaH和ial 基因特異片段與基因庫中標(biāo)準(zhǔn)菌株序列一致性為100%,從而建立了一種快速、特異、敏感的分子生物學(xué)診斷方法對腹瀉患者糞便中的痢疾桿菌致病基因ipaH及ial 進(jìn)行檢測。

　　1.2 多重PCR(multiplex PCR)

　　多重PCR是在同一個反應(yīng)管中用多對引物同時擴(kuò)增幾條DNA片段的方法,其反應(yīng)原理、反應(yīng)試劑和操作過程與一般PCR相同。多重PCR在腹瀉致病菌的診斷上已得到較好應(yīng)用,可以同時檢測一種致病菌的多個基因,也可以同時檢測多種致病菌[47]。Belanger等[8]運(yùn)用熒光定量多重PCR,通過檢測艱難梭菌的毒素基因tcdA和tcdB可快速鑒定糞便樣本中艱難梭菌。趙明光等[9]通過建立多重PCR反應(yīng)體系,用一次PCR即可檢測致病性大腸埃希菌、沙門菌、志賀菌、空腸彎曲菌這四種兒童常見腸道致病菌,靈敏度達(dá)10～100 cfu/ml.2005年P(guān)hantouamath等[10]建立多重PCR法檢測志賀菌屬的ipaH和ial致病基因,以診斷細(xì)菌性痢疾。Thong等[11]針對志賀菌的set1A、set1B、ial、ipaH基因,設(shè)計(jì)不同的引物對,在同一PCR反應(yīng)體系內(nèi)同時擴(kuò)增set1A、set1B、ial、ipaH基因,對84株福氏志賀菌、15株宋氏志賀菌、10株痢疾桿菌、1株鮑特氏菌進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示重現(xiàn)性為100%,最低檢測濃度為100 cfu/ml,并且不出現(xiàn)假陽性和假陰性。與其他常規(guī)方法相比,多重PCR省時、省力、靈敏性更高,在做更多基因靶點(diǎn)時優(yōu)勢更突出。

　　1.3 巢式PCR(nested PCR)

　　是指利用兩套 PCR 引物(巢式引物)進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)。在第一輪擴(kuò)增中,外引物以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物,該產(chǎn)物在內(nèi)引物存在下進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。由于此反應(yīng)有兩次PCR擴(kuò)增,降低了擴(kuò)增多個靶位點(diǎn)的可能性,增加了檢測的敏感性;加上兩對引物與檢測模板的配對,增加了檢測的可靠性。大腸彎曲桿菌及空腸彎曲桿菌在樣品中含量少,用常規(guī)的檢測方法不易檢測,Bang等[12]以16S rRNA設(shè)計(jì)兩對引物,先進(jìn)行通用引物PCR,擴(kuò)增產(chǎn)物1495 bp,以第二對引物進(jìn)行巢式PCR,擴(kuò)增產(chǎn)物833 bp.此外,以馬尿酸酶基因設(shè)計(jì)4條引物,先以其中2條進(jìn)行PCR,擴(kuò)增產(chǎn)物長度為1028 bp,再同時加入4條引物進(jìn)行巢式PCR,擴(kuò)增產(chǎn)物分別為383 bp,645 bp.利用該技術(shù),檢出敏感性達(dá)2～3 cfu/ml,檢測時間由2～4周減少到1天。

　　1.4 實(shí)時熒光PCR技術(shù)(real  time fluorescence PCR)

　　該技術(shù)在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號積累實(shí)時檢測整個PCR進(jìn)程,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量的方法,其不僅具有普通PCR的高靈敏性,而且由于應(yīng)用了熒光探針,可以通過光電傳導(dǎo)系統(tǒng)直接探測PCR擴(kuò)增過程中熒光信號的變化以獲得定量結(jié)果,所以還具有DNA雜交的高特異性和光譜技術(shù)的高精確性。2009年,徐德順等[13]利用特異性的TaqMan熒光定量PCR技術(shù),以大腸桿菌O157H7的rfbE基因作為靶序列,設(shè)計(jì)一對引物和探針,以大腸桿菌O157H7菌株提取核酸DNA作為模板,建立的反應(yīng)體系在引物和探針的濃度為0.6 μmoL/L、0.8 μmoL/L,Mg2+濃度為4 mmoL/L時,具有良好的特異性和敏感性,在鴨沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌EIEC、副溶血性弧菌、奇異變形桿菌、單增李斯特菌、福氏志賀氏菌等10菌株的檢測中,除大腸桿菌O157H7出現(xiàn)很好的陽性外,其余菌株均為陰性,在純菌條件下,定量檢測低限17 cfu/ml。穩(wěn)定性分析表明同一樣品重復(fù)檢測3次Ct值的變異系數(shù)均小于5%,本方法從核酸提取至完成檢測最快能在3小時內(nèi)完成,敏感度可達(dá)10 cfu/ ml,而且該方法實(shí)行完全閉管式操作,避免了常規(guī)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染和假陽性的問題。

　　2 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)

　　蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)近年來在很多方面得到了廣泛的應(yīng)用,在細(xì)菌鑒定方面的研究也已起步。細(xì)菌種類繁多,其蛋白質(zhì)是細(xì)菌功能的執(zhí)行者,不同蛋白種類決定細(xì)菌千變?nèi)f化的功能和特征。

　　2.1 雙向電泳技術(shù)(Twodimensional gel electrophoresis)

　　雙向電泳是一項(xiàng)基于蛋白的電荷和分子量來分離蛋白的技術(shù)。首先基于蛋白的固有電荷,通過等電聚焦(isoelectric focusing，IEF)進(jìn)行第一向蛋白分離,然后根據(jù)蛋白的分子量,在第二向中通過SDSPAGE電泳進(jìn)行蛋白分離。雙向電泳技術(shù)已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中常用的技術(shù)。夏金蘭等[14]優(yōu)化了大腸桿菌外膜蛋白雙向電泳技術(shù)體系,通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)樣品裂解液中包含低濃度的tris是外膜蛋白雙向電泳成功的關(guān)鍵因素,Chaps與ASB14或NP40結(jié)合使用可顯著提高外膜蛋白的溶解能力,縮短聚焦時間,建立了其雙向電泳圖譜。Liao等[15]曾對志賀菌標(biāo)準(zhǔn)株作過全菌蛋白質(zhì)雙向電泳,共得到488的個蛋白質(zhì)點(diǎn),Ying[16]及Jennison[17]等也分別對其外膜蛋白進(jìn)行雙向電泳,得到了外膜蛋白的電泳圖譜,利于今后細(xì)菌致病性、抗菌藥物及疫苗的研究。

　　2.2 基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDITOFMS)

　　MALDITOFMS是將生物大分子與一特定的基質(zhì)分子混合,用激光照射樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜,基質(zhì)從激光中吸收能量傳遞給生物分子,軟電離出一個電子。利用這種技術(shù)可以得到分子的母體離子和一些大的碎片離子,對于幾十萬甚至幾百萬質(zhì)量數(shù)的分子可以進(jìn)行檢測,而且時間飛行質(zhì)譜儀的分析時間快,原則上它可以在一次電離事件中給出所有離子的質(zhì)譜圖。研究表明,基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜可檢測細(xì)菌蛋白表達(dá),并可根據(jù)蛋白表達(dá)對細(xì)菌進(jìn)行快速鑒定[18,19]。1996年,Claydon等[20]采用MALDITOFMS成功鑒定了G-和G+細(xì)菌,表明不同種屬的細(xì)菌具有不同的蛋白指紋圖譜,同一種細(xì)菌具有相似的蛋白指紋圖譜,根據(jù)細(xì)菌蛋白指紋圖譜可對細(xì)菌進(jìn)行快速鑒定。王曄茹等[21]利用優(yōu)化的MALDITOFMS實(shí)驗(yàn)條件對從門診腹瀉患者糞便分離的88株沙門菌進(jìn)行了檢測和分型,并與血清學(xué)分型、耐藥分型和脈沖場凝膠電泳(PFGE)分型進(jìn)行比較,結(jié)果在反映親緣關(guān)系的差異水平值為100時,88株沙門菌被分為15個MALDITOFMS型別。MALDITOFMS分型結(jié)合耐藥表型分型,可以將88株沙門菌分成44個亞型。MALDITOFMS分型結(jié)合血清學(xué)分型,可以將88株菌分成46個亞型。MALDITOFMS分型結(jié)合PFGE分型,可以將88株菌分成64個亞型,說明MALDITOFMS在沙門菌分型中具有很好的分型能力。

　　2.3 表面加強(qiáng)激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(SELDITOFMS)

　　SELDITOFMS由2002年諾貝爾化學(xué)獎得主田中發(fā)明,蛋白芯片表面經(jīng)過化學(xué)或生物化學(xué)處理,特異地與被測標(biāo)本的蛋白結(jié)合,通過選擇性洗滌,獲得高分辨率的保留蛋白譜。當(dāng)加入能量分子后,芯片上保留的蛋白形成晶體,在激光照射下,晶體解離,帶電分子在通過電場時加速,檢測儀記錄飛行時間的長短。質(zhì)荷比越小,飛行時間越短,就會被最先檢測到。檢測信號轉(zhuǎn)換后,被測蛋白質(zhì)以一系列峰值的形式呈現(xiàn),即蛋白指紋圖譜。該技術(shù)具有樣本用量小,敏感性高(<1 fmol),檢測蛋白質(zhì)分子量范圍大(0～500 kD),檢測速度快,可重復(fù)性較好等優(yōu)點(diǎn),是目前蛋白組學(xué)研究較先進(jìn)的技術(shù)。國內(nèi)外一些相關(guān)試驗(yàn)表明SELDITOFMS在細(xì)菌鑒定方面有很高應(yīng)用價(jià)值。肖代雯等[22]利用SELDITOFMS建立了E.coli的特征性蛋白指紋圖譜,為快速診斷大腸埃希菌感染提供了新的思路。

　　3 結(jié)語

　　綜上所述,準(zhǔn)確、簡便、快速鑒定常見腹瀉致病菌無論對臨床診斷和治療,還是對實(shí)驗(yàn)研究都有重要意義。傳統(tǒng)方法不僅耗時,而且敏感性和特異性低。新興的分子生物學(xué)技術(shù)尤其蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在臨床常見腹瀉致病菌檢測和鑒定中具有操作簡便、省時省力、敏感性高、特異性好、準(zhǔn)確、可靠等優(yōu)點(diǎn),在腹瀉致病菌鑒定中有著巨大的潛力和廣闊的應(yīng)用前景。目前分子生物學(xué)方法尤其蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在臨床常見腹瀉致病菌中的應(yīng)用處于研究階段,在方法學(xué)和臨床實(shí)驗(yàn)室的具體應(yīng)用中還需要進(jìn)一步深入研究。（參考文獻(xiàn)：臨床常見腹瀉致病菌的快速鑒定方法研究進(jìn)展，齊偉，成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)2010年第5卷第2期）

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