臨床常見腹瀉致病菌的快速鑒定方法研究進展

　　腹瀉是一種發病率高并流行于世界各地的胃腸道傳染病,其發病率僅次于上呼吸道感染[1],在我國,感染性腹瀉發病率居所有傳染病首位[2]。目前細菌性腹瀉的初步診斷主要是根據患者的臨床表現結合流行病學依據和醫生的經驗,在診斷明確之前使用廣譜抗生素,易導致細菌耐藥。因此致病菌快速鑒定在疾病的診斷、臨床用藥、疾病控制等方面都有非常重要的意義。臨床常規鑒定主要根據細菌的形態、染色性、理化性質進行鑒定,操作繁瑣、耗時、靈敏性及特異性差。新興的分子生物學和蛋白組學技術為快速準確鑒定臨床常見腹瀉致病菌提供了保證。本文就分子生物學和蛋白組學技術在臨床常見腹瀉致病菌檢測和鑒定中的應用進行扼要綜述。

　　1 常見腹瀉致病菌常規分子生物學檢測方法

　　1.1 常規

　　PCR技術是一種特異性擴增DNA的體外酶促反應,用于擴增位于兩段已知序列之間的DNA,利用特異DNA序列鑒定細菌的方法，因其操作安全、簡便快速、靈敏度高、特異性強等優點受到廣泛重視。李小麗等[3]采用常規PCR方法從48例腹瀉患者糞便中擴增痢疾桿菌侵襲質�；�因(ipah)和侵襲相關基因位點(ial)基因,其基因陽性率分別為100%(48/48)、70.8%(34/48),電泳結果顯示擴增到的ipaH和ial 基因特異片段與基因庫中標準菌株序列一致性為100%,從而建立了一種快速、特異、敏感的分子生物學診斷方法對腹瀉患者糞便中的痢疾桿菌致病基因ipaH及ial 進行檢測。

　　1.2 多重PCR(multiplex PCR)

　　多重PCR是在同一個反應管中用多對引物同時擴增幾條DNA片段的方法,其反應原理、反應試劑和操作過程與一般PCR相同。多重PCR在腹瀉致病菌的診斷上已得到較好應用,可以同時檢測一種致病菌的多個基因,也可以同時檢測多種致病菌[4��7]。Belanger等[8]運用熒光定量多重PCR,通過檢測艱難梭菌的毒素基因tcdA和tcdB可快速鑒定糞便樣本中艱難梭菌。趙明光等[9]通過建立多重PCR反應體系,用一次PCR即可檢測致病性大腸埃希菌、沙門菌、志賀菌、空腸彎曲菌這四種兒童常見腸道致病菌,靈敏度達10～100 cfu/ml.2005年Phantouamath等[10]建立多重PCR法檢測志賀菌屬的ipaH和ial致病基因,以診斷細菌性痢疾。Thong等[11]針對志賀菌的set1A、set1B、ial、ipaH基因,設計不同的引物對,在同一PCR反應體系內同時擴增set1A、set1B、ial、ipaH基因,對84株福氏志賀菌、15株宋氏志賀菌、10株痢疾桿菌、1株鮑特氏菌進行檢測,結果顯示重現性為100%,最低檢測濃度為100 cfu/ml,并且不出現假陽性和假陰性。與其他常規方法相比,多重PCR省時、省力、靈敏性更高,在做更多基因靶點時優勢更突出。

　　1.3 巢式PCR(nested PCR)

　　是指利用兩套 PCR 引物(巢式引物)進行兩輪PCR擴增反應。在第一輪擴增中,外引物以產生擴增產物,該產物在內引物存在下進行第二輪擴增。由于此反應有兩次PCR擴增,降低了擴增多個靶位點的可能性,增加了檢測的敏感性;加上兩對引物與檢測模板的配對,增加了檢測的可靠性。大腸彎曲桿菌及空腸彎曲桿菌在樣品中含量少,用常規的檢測方法不易檢測,Bang等[12]以16S rRNA設計兩對引物,先進行通用引物PCR,擴增產物1495 bp,以第二對引物進行巢式PCR,擴增產物833 bp.此外,以馬尿酸酶基因設計4條引物,先以其中2條進行PCR,擴增產物長度為1028 bp,再同時加入4條引物進行巢式PCR,擴增產物分別為383 bp,645 bp.利用該技術,檢出敏感性達2～3 cfu/ml,檢測時間由2～4周減少到1天。

　　1.4 實時熒光PCR技術(real �� time fluorescence PCR)

　　該技術在PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號積累實時檢測整個PCR進程,最后通過標準曲線對未知模板進行定量的方法,其不僅具有普通PCR的高靈敏性,而且由于應用了熒光探針,可以通過光電傳導系統直接探測PCR擴增過程中熒光信號的變化以獲得定量結果,所以還具有DNA雜交的高特異性和光譜技術的高精確性。2009年,徐德順等[13]利用特異性的TaqMan熒光定量PCR技術,以大腸桿菌O157H7的rfbE基因作為靶序列,設計一對引物和探針,以大腸桿菌O157H7菌株提取核酸DNA作為模板,建立的反應體系在引物和探針的濃度為0.6 μmoL/L、0.8 μmoL/L,Mg2+濃度為4 mmoL/L時,具有良好的特異性和敏感性,在鴨沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌EIEC、副溶血性弧菌、奇異變形桿菌、單增李斯特菌、福氏志賀氏菌等10菌株的檢測中,除大腸桿菌O157H7出現很好的陽性外,其余菌株均為陰性,在純菌條件下,定量檢測低限17 cfu/ml。穩定性分析表明同一樣品重復檢測3次Ct值的變異系數均小于5%,本方法從核酸提取至完成檢測最快能在3小時內完成,敏感度可達10 cfu/ ml,而且該方法實行完全閉管式操作,避免了常規PCR擴增產物污染和假陽性的問題。

　　2 蛋白質組學技術

　　蛋白質組學技術近年來在很多方面得到了廣泛的應用,在細菌鑒定方面的研究也已起步。細菌種類繁多,其蛋白質是細菌功能的執行者,不同蛋白種類決定細菌千變萬化的功能和特征。

　　2.1 雙向電泳技術(Two�瞕imensional gel electrophoresis)

　　雙向電泳是一項基于蛋白的電荷和分子量來分離蛋白的技術。首先基于蛋白的固有電荷,通過等電聚焦(isoelectric focusing，IEF)進行第一向蛋白分離,然后根據蛋白的分子量,在第二向中通過SDS�睵AGE電泳進行蛋白分離。雙向電泳技術已經成為醫學檢驗中常用的技術。夏金蘭等[14]優化了大腸桿菌外膜蛋白雙向電泳技術體系,通過實驗發現樣品裂解液中包含低濃度的tris是外膜蛋白雙向電泳成功的關鍵因素,Chaps與ASB��14或NP��40結合使用可顯著提高外膜蛋白的溶解能力,縮短聚焦時間,建立了其雙向電泳圖譜。Liao等[15]曾對志賀菌標準株作過全菌蛋白質雙向電泳,共得到488的個蛋白質點,Ying[16]及Jennison[17]等也分別對其外膜蛋白進行雙向電泳,得到了外膜蛋白的電泳圖譜,利于今后細菌致病性、抗菌藥物及疫苗的研究。

　　2.2 基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI�睺OF�睲S)

　　MALDI�睺OF�睲S是將生物大分子與一特定的基質分子混合,用激光照射樣品與基質形成的共結晶薄膜,基質從激光中吸收能量傳遞給生物分子,軟電離出一個電子。利用這種技術可以得到分子的母體離子和一些大的碎片離子,對于幾十萬甚至幾百萬質量數的分子可以進行檢測,而且時間飛行質譜儀的分析時間快,原則上它可以在一次電離事件中給出所有離子的質譜圖。研究表明,基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜可檢測細菌蛋白表達,并可根據蛋白表達對細菌進行快速鑒定[18,19]。1996年,Claydon等[20]采用MALDI�睺OF�睲S成功鑒定了G-和G+細菌,表明不同種屬的細菌具有不同的蛋白指紋圖譜,同一種細菌具有相似的蛋白指紋圖譜,根據細菌蛋白指紋圖譜可對細菌進行快速鑒定。王曄茹等[21]利用優化的MALDI�睺OF�睲S實驗條件對從門診腹瀉患者糞便分離的88株沙門菌進行了檢測和分型,并與血清學分型、耐藥分型和脈沖場凝膠電泳(PFGE)分型進行比較,結果在反映親緣關系的差異水平值為100時,88株沙門菌被分為15個MALDI�睺OF�睲S型別。MALDI�睺OF�睲S分型結合耐藥表型分型,可以將88株沙門菌分成44個亞型。MALDI�睺OF�睲S分型結合血清學分型,可以將88株菌分成46個亞型。MALDI�睺OF�睲S分型結合PFGE分型,可以將88株菌分成64個亞型,說明MALDI�睺OF�睲S在沙門菌分型中具有很好的分型能力。

　　2.3 表面加強激光解析電離飛行時間質譜(SELDI�睺OF�睲S)

　　SELDI�睺OF�睲S由2002年諾貝爾化學獎得主田中發明,蛋白芯片表面經過化學或生物化學處理,特異地與被測標本的蛋白結合,通過選擇性洗滌,獲得高分辨率的保留蛋白譜。當加入能量分子后,芯片上保留的蛋白形成晶體,在激光照射下,晶體解離,帶電分子在通過電場時加速,檢測儀記錄飛行時間的長短。質荷比越小,飛行時間越短,就會被最先檢測到。檢測信號轉換后,被測蛋白質以一系列峰值的形式呈現,即蛋白指紋圖譜。該技術具有樣本用量小,敏感性高(<1 fmol),檢測蛋白質分子量范圍大(0～500 kD),檢測速度快,可重復性較好等優點,是目前蛋白組學研究較先進的技術。國內外一些相關試驗表明SELDI�睺OF�睲S在細菌鑒定方面有很高應用價值。肖代雯等[22]利用SELDI�睺OF�睲S建立了E.coli的特征性蛋白指紋圖譜,為快速診斷大腸埃希菌感染提供了新的思路。

　　3 結語

　　綜上所述,準確、簡便、快速鑒定常見腹瀉致病菌無論對臨床診斷和治療,還是對實驗研究都有重要意義。傳統方法不僅耗時,而且敏感性和特異性低。新興的分子生物學技術尤其蛋白質組學技術在臨床常見腹瀉致病菌檢測和鑒定中具有操作簡便、省時省力、敏感性高、特異性好、準確、可靠等優點,在腹瀉致病菌鑒定中有著巨大的潛力和廣闊的應用前景。目前分子生物學方法尤其蛋白質組學技術在臨床常見腹瀉致病菌中的應用處于研究階段,在方法學和臨床實驗室的具體應用中還需要進一步深入研究。（參考文獻：臨床常見腹瀉致病菌的快速鑒定方法研究進展，齊偉，成都醫學院學報2010年第5卷第2期 ）

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