胸腺肽α1對慢性乙型肝炎患者免疫系統的影響

Abstract
AIM:To realize effect of thymosin-a1 (Ta1) on immune function with chronic hepatitis B (CHB) and to evaluate the efficacy of  Ta1 in the treatment of CHB.
METHODS:Sixty patients with CHB were randomly chosen. Twenty-five cases were received Ta1 (1.6 mg, sc, twice a week, 3-6mo) and thirty-five were received Ta1 combined with Lamivudine (0.1 g, po, once a day, 3-6 mo). Hepatic function, virological analyses (HBeAg, HBsAg, HBV-DNA) and immunological analyses (periperal blood T lymphocytes subset, IFN-aand IL-4 levels) from patients in pretreatment and posttreatment were observed.
RESULTS:At the end of treatment, ALT and T-Bil were decreased in the group of Ta1 combined with Lamivudine (P <0.01), HBeAg/HBsAg remained negative (n =9) and HBV-DNA levels were also low (n =14) in the group of Ta1 combined with Lamivudine (P <0.01 and P <0.05, respectively) as compared with healthy individuals. CD₄⁺ T Cell (from 31.3±2.4 to 36.1±2.5), the level of IFN-a(from 71.3±21.0 to 83.7±21.4) and Th1/Th2 (from 0.79±0.2 to 0.98±0.3) increased in the group of Ta1 (P <0.01, P <0.05 and P <0.05, respectively).
CONCLUSION: Ta1 is efficient to treat patients with CHB because it can elevate the level of cellular immunity, which is beneficial to viral clearance.
Duan GR, Nie QH, Zhou YX, Wang QC, Tian CY, Liu LY, Xue HA. Effect of thymosin-a1 on immune function with chronic hepatitis B. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi  2003;11(6):701-704

摘要
目的:了解胸腺肽a1(Ta1)對慢性乙型肝炎患者免疫系統的影響，評價Ta1對慢性乙型病毒性肝炎的療效.

方法:選擇60例慢性乙型肝炎患者，其中Ta1組25例，給予Ta1(1.6mg，sc，2次/wk，3-6 mo)治療，聯合組35例，給予Ta1聯合賀普丁(0.1 g，po，1次/d，3-6 mo)治療，另選60例作為對照組，僅給予保肝治療. 應用雙抗體酶聯分析法檢測治療前后血清中IFN-g和IL-4的濃度，以IFN-g代表Th1，IL-4代表Th2，從而計算Th1/Th2比值；采用流式細胞儀觀察外周血CD₄⁺T，CD₈⁺T細胞亞群.

結果:聯合組與對照組比，治療后肝功能改善顯著(P <0.01) ;聯合組乙型肝炎病毒標志物HBsAg或HBeAg陰轉(9例)及HBV-DNA定量指標降低(14例)，與對照組比，均具有統計學差異(P <0.01; P <0.05). 但Ta1組分別與對照組、聯合組比，無統計學差異(P >0.05). Ta1組治療后CD₄⁺T細胞增高(由31.3±2.4增高到36.1±2.5)具有統計學意義(P <0.01)，CD₈⁺T細胞稍高且CD₄⁺/CD₈⁺無明顯變化，相差無統計學意義(P >0.05) ; IFN-g濃度(由71.3±21.0增高到83.7±21.4)及Th1/Th2比值升高(由0.79±0.2增高到0.98±0.3)均有統計學意義(P均<0.05)，但IL-4表達水平變化無統計學意義.

結論:Ta1能提高機體的細胞免疫功能，有利于病毒清除和疾病的恢復.

段國榮,聶青和,周永興,王全楚,田長印,劉拉羊,薛紅安. 胸腺肽a1對慢性乙型肝炎患者免疫系統的影響. 世界華人消化雜志  2003;11(6):701-704
http://www.wjgnet.com/1009-3079/11/701.asp

0   引言
我國是病毒性肝炎的高發區，乙型肝炎居首位，目前尚缺乏特效治療. 目前抗病毒藥物效果不盡人意. 因此，尋找更有效的治療措施，一直為臨床醫師及科研人員所關注^[1-17]. 化學合成的胸腺肽a1(thymosin-a1， 日達仙，Ta1)對病毒性肝炎的治療雖已有報道，但多在于觀察肝功能、病毒復制指標等. 而對于細胞免疫指標的檢測報道較少，尤其是Th1/Th2及外周血T淋巴細胞亞群的變化. 為此，我們旨在觀察患者外周血Th1/Th2及T淋巴細胞亞群的變化，同時對患者肝功能生化指標及病毒復制指標進行觀察分析，從而評價Ta1對CHB的療效.

1   材料和方法
1.1材料  慢性乙型肝炎(CHB)患者60例來自第四軍醫大學唐都醫院，西安交通大學第二醫院及西安市中心醫院. 其中Ta1組25例，聯合組35例，另選60例作為對照組. 男21例，女14例. 年齡21-60(平均40)歲. 診斷符合1995年(北京)第五次全國傳染病與寄生蟲病學術會議修訂的標準. IFN-g和IL-4雙單克隆抗體ELISA檢測試劑盒，均購自深圳晶美生物工程有限公司，批號991225.  HBV-DNA  PCR 檢測試劑盒購自廣州市中山醫科大學達安基因股份有限公司，批號S19990003. CD₄-FITC和 CD₈-PE 產地法國馬賽(immunotech france). Epics-Profile二型流式細胞儀，美國Coulter公司生產.
1.2方法  Ta1(日達仙，美國賽生公司) 1.6 mg，皮下注射，2次/wk，其中35例患者加用抗病毒藥物(賀普丁)0.1 g，口服，1次/d，同時配合多種維生素，肌苷等常規保肝治療. 療程3-6 mo. 隨機選擇60例CHB患者作為對照，僅給予保肝等對癥處理. 患者于治療前后抽血檢測肝功能. 血清病毒學指標：HBsAg，抗-HBs，HBeAg，抗-HBe，抗-HBc，PCR-HBV-DNA. 細胞免疫指標：CD₄⁺T，CD₈⁺T，CD₄⁺/CD₈⁺及細胞因子IFN-g，IL-4濃度. 藥物毒副作用觀察. 外周血T細胞亞群檢測步驟：先加20 mL雙標抗體于小試管底，再加抗凝血100 mL，混勻，放置室溫(18-25 °C)孵育30min；加RBC溶解液1 mL，待RBC溶解后上流式細胞儀檢測；波長488 nm時FITC(異硫氰酸熒光素)呈藍-綠熒光，PE(藻紅蛋白)呈紅色熒光，計數3 000個細胞，記錄分析直方圖，數據經ELITE軟件處理. 血清IFN-g檢測步驟：從已平衡至室溫的密封袋中取出所需板條，分別將標本及不同濃度標準品(100 mL/孔)加入相應孔中，然后再加入生物素化抗體工作液(50 mL/孔)和酶結合物(20-25 °C)共同孵育120 min. 洗板3次. 先后加入底物A，B各100 mL/孔，避光置室溫10-30 min. 加入終止液50 mL/ 孔，混勻后即刻在ELISA讀數儀上測量A450值，繪制標準曲線，并測定各血清標本中IFN-g的濃度(ng/L). 血清IL-4檢測步驟同上.
         統計學處理  結果數據采用 ，方差分析，x²檢驗

2   結果
聯合組與對照組比，T-Bil和ALT相差有統計學意義(P <0.01，表1) ; Tα1組與對照組比及Tα1組與聯合組比，均無統計學差異(P >0.05). 在Ta1組未見藥物副反應；在聯合組治療過程中2例發生輕度惡心，1例出現白細胞輕微下降，治療結束后自行恢復.
2.1治療后肝功能及病毒學標志  檢測病毒學標志，在Ta1組和聯合組HBeAg或HBsAg陰轉共13例(13/60)，HBV-DNA定量指標下降20例(20/60). 13例HBeAg或HBsAg陰轉同時伴隨HBV-DNA定量指標降低. 在肝功能復常方面:聯合組與對照組比，有統計學差異(x² =8.681， P =0.0032) ;在陰轉方面:聯合組與對照組比，相差有統計學意義(x² =7.518，P =0.0 061) ;在HBV-DNA定量指標下降方面:聯合組與對照組比，相差有統計學意義(x² =4.448，P =0.035，表2，3)Ta1組與對照組比及Ta1組與聯合組比，均無統計學差異(P >0.05).

表1   Ta1治療CHB前后肝功能差值( )

^bP <0.01，vs對照組比.

表2  Ta1治療CHB肝功能及病毒學指標變化(n)

^aP <0.05;  ^bP <0.01，vs 對照組比.

表3  Ta1治療前CHB HBV-DNA定量拷貝分布情況(n)

2.2細胞免疫變化  Ta1組治療前后CD4+T細胞增高具有統計學意義(t =6.93，P =0.000)，CD₈⁺T細胞略高且CD₄⁺/CD₈⁺相差無統計學意義(t =1.50，P=0.141; t =1.41，P =0.1 638) ;治療前后IFN-g表達水平及Th1/Th2比值變化有統計學差異(t =2.07，P =0.0 441; t =2.63，P =0.0 117)，IL-4表達水平變化無統計學意義(t =0.41，P =0.6 856，表4，圖1).

表4  Ta1組治療CHB后細胞免疫指標變化

^aP <0.05，^bP <0.01，vs治療前.   

CD₄⁺ T  32.4%(治療前)
CD₈⁺ T  37.3 %(治療前)
CD₄⁺ T  35.7 %(治療后)
CD₈⁺ T  38.1 %(治療后).
圖1(PDF) Ta1治療CHB前后血淋巴細胞流式細胞儀檢測.

3   討論
病毒性肝炎是我國常見病多發病，目前尚缺乏特效治療，其主要原因是發病機制較為復雜，尚未完全闡明^[18-41]. 多數資料表明，CHB患者細胞免疫功能低下^[42,43]. Ta1能促進T細胞成熟和影響免疫調節細胞的功能，還能增強IFN-g及IL-2等細胞因子的生成，促進免疫缺陷的重建. 這也是Ta1用于CHB治療的理論依據. 本研究顯示，聯合組與對照組比，治療前后肝功能顯著改善，Ta1組分別與對照組、聯合組比，肝功能改善無統計學意義；聯合組與對照組相比，治療前后病毒學標志，包括HBeAg或HBsAg陰轉，HBV-DNA定量指標降低均具有統計學差異，但Ta1組分別與對照組、聯合組比差異無統計學意義. 可見，無論在肝功能改善方面，還是在病毒學標志方面，Ta1聯合抗病毒藥物(賀普丁)均顯示良好的治療效果. 本研究還顯示，在Ta1組，治療前后CD₄⁺相差具有統計學意義，治療后CD₈⁺稍高，CD₄⁺/CD₈⁺無明顯變化，相差無統計學意義. 這表明Ta1能提高機體的細胞免疫功能，CD₄⁺增高可促使機體分泌IFN-g、IL-2等細胞因子，有利于病毒清除. 治療后IFN-g水平較治療前高，這可能與 Ta1能增強IFN-g的生成有關，但仍低于正常血清IFN-g水平(結合血清細胞因子檢測結果). 可能原因是：(1)患者血清中可能存在誘生IFN的抑制因子；(2)產生IFN的活性細胞功能降低；(3)藥物劑量不足或療程不夠長. 因此，加用IFN-g治療或Ta1療程延長，可能效果更好.
        早在1986年Mosmann et al 就發現小鼠的CD₄⁺細胞株接受抗原刺激可分化成Th1和Th2兩個亞群. 前者分泌IL-2，IFN-g，TFN-b等可促進細胞免疫. 后者分泌IL-4，IL-5，IL-6，IL-10，IL-13等可促進體液免疫. 以后研究又進一步證實在人類也存在這兩種亞型. 日前，越來越多的證據表明，Th1/Th2平衡的變化會影響感染的結局^[44-48]. 我們曾報道35例CHC患者Th2類細胞因子占優勢，還報道30例CHB患者Th2類細胞因子較Th1類細胞因子水平高，分別與正常對照組比，均有統計學差異. 本研究中，以IFN-g代表Th1，IL-4代表Th2，從而計算Th1/Th2比值. 在Ta1組，治療前后Th1/Th2比值變化有統計學差異，可能是由于IFN-g濃度變化幅度大于IL-4所致. Th1/Th2比值增高可促進機體細胞免疫應答，有利于病毒清除和疾病的恢復.
       總之，如何有效提高機體的細胞免疫功能，如何終止病毒復制，從而維持患者的肝功能穩定，是目前急需解決的問題. 免疫調節劑(Ta1)有利于肝炎病毒的清除和疾病的恢復. 加大藥物劑量或延長療程可能效果更好. 聯合抗病毒藥物(賀普丁)治療可能更具優勢，既可利用Ta1提高細胞免疫功能的特點，又可利用賀普丁持續抑制病毒復制的特點，從而達到提高療效的目的.
致謝: 感謝第四軍醫大學唐都醫院中心實驗室張盈華主任的大力支持.