乙型肝炎病毒遺傳異質(zhì)性對干擾素應(yīng)答性的影響

　　蘭  林，王宇明

　　蘭林，王宇明,中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院全軍感染病研究所 

 

　　摘要

　　迄今IFN-α仍是治療乙型肝炎的主要抗病毒藥物，但其總體療效并不理想.究其原因，HBV基因組的多樣性可能是重要原因之一.HBV種群具有高度的異質(zhì)性，存在著多種不同的血清型、基因型及變異株，即使在單個感染個體內(nèi)，也可能包含異質(zhì)性的HBV病毒群體（準(zhǔn)種）.研究發(fā)現(xiàn)不同的HBV株對IFN-α治療的敏感性不同，個體內(nèi)準(zhǔn)種的異質(zhì)性程度也對擾素治療的應(yīng)答性有影響.因此，正確深入地認(rèn)知和分析HBV遺傳異質(zhì)性，對闡明影響IFN-α治療的病毒學(xué)因素有著重要的意義.

　　蘭林， 王宇明.乙型肝炎病毒遺傳異質(zhì)性對干擾素應(yīng)答性的影響.世界華人消化雜志 2002;10(6):696-698

　　

　　0  引言

　　乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）是目前威脅人類健康的最主要病原體之一. 他屬于嗜肝DNA病毒科（hepadna viridae）家族. 其基因組由一個呈部分雙鏈、松馳的環(huán)狀DNA分子構(gòu)成，DNA大約長3200（3182～3221）個堿基（bp）對. 其上有4個開放閱讀框（open reading frame，ORF），轉(zhuǎn)錄至少4種mRNA，即3.5kb mRNA、 2.4kb mRNA、2.1kb mRNA和0.7kb mRNA，其中3.5kb mRNA又是病毒的前基因組RNA（pregenome RNA）. 翻譯至少7種病毒蛋白質(zhì)；S-ORF區(qū)的PreS1蛋白、PreS2蛋白和HBsAg，C-ORF區(qū)的HBeAg和HBcAg，P-ORF區(qū)的DNA聚合酶及X-ORF區(qū)的X蛋白. HBV基因組轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子包括4種啟動子（promoter）、2種增強(qiáng)子（enhancer）和多種其他cis活性因子區(qū). 其中核心啟動子又可再分為核心上游調(diào)節(jié)序列（core upstream regulatory sequences，CURS）和基本核心啟動子（basic core promoter，BCP）2區(qū). cis活性因子區(qū)有；位于S基因內(nèi)的糖皮質(zhì)應(yīng)答元件（glucocorticoid responsive element，GRE），位于C基因上游的負(fù)性調(diào)節(jié)元件（negative regulatory element, NRE），肝細(xì)胞核因子（hepatocyte nuclear factor，HNF）結(jié)合位點(diǎn)，Sp1結(jié)合位點(diǎn)，位于C基因之中的轉(zhuǎn)錄終止信號（termination signal）以及最近在增強(qiáng)子I區(qū)域內(nèi)新發(fā)現(xiàn)的干擾素（interferon，IFN）刺激調(diào)節(jié)成分（interferon-stimulated regulatory element，ISRE）樣區(qū)域等. 病毒基因組存在著明顯的基因重疊現(xiàn)象. HBV最大的特點(diǎn)是復(fù)制必需經(jīng)過核糖核酸中間體（RNA intermediates ）逆轉(zhuǎn)錄（reverser transcription）過程. HBV種群的異質(zhì)性很大，按血清學(xué)分類可分為adr 等9 種血清型，按基因型分類可分為A～G共7種基因型. 別外各型還存在著眾多的變異株.

　　      HBV感染可引起一系列的嚴(yán)重疾病，如暴發(fā)性肝炎、慢性活動性肝炎、肝硬化及肝細(xì)胞肝癌. 全球超過3億人口是慢性HBV攜帶者，在我國HBsAg陽性率達(dá)到總?cè)丝诘?0％. 目前使用的有效抗病毒藥物主要有IFN-α和拉米夫定（lamivudine）. 拉米夫定是一種新使用的核苷類似物抗病毒藥，其遠(yuǎn)期療效尚需確認(rèn)，初步結(jié)果提示他易誘導(dǎo)病毒變異株出現(xiàn)，從而產(chǎn)生耐藥；同時，因不能清除cccDNA分子，易致停藥后反跳；對HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換效果不佳，且療程偏長［1]. IFN-α屬于IFN-α/β系統(tǒng)，具有抗病毒、抗增生、免疫調(diào)節(jié)作用及其他細(xì)胞效應(yīng). 在人體，IFN-α通過兩條途徑產(chǎn)生抗病毒作用；一是誘導(dǎo)感染細(xì)胞表達(dá)至少3種抗病毒蛋白；2''-5''寡聚腺苷酸合成酶、dsRNA-依賴的蛋白激酶和Mx蛋白，使細(xì)胞處于抗病毒狀態(tài). 二是調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng). 然而至今IFN-α抗HBV的確切機(jī)制并不完全清楚. 因?yàn)槿狈�動物模型，有關(guān)IFN-α抗HBV的研究大部分是在體外進(jìn)行的. 由于使用的肝癌細(xì)胞株不同，各研究者所得到的結(jié)果也不完全相同，不過大多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)IFN-α能改變HBV多種蛋白質(zhì)的合成�能箚緳n筒《狙腔�因组RNA和病毒前基因組的穩(wěn)定性. IFN-α的免疫調(diào)節(jié)作用是多方面的，主要表現(xiàn)在以下幾個方面［2，8]： (1)增強(qiáng)MHC I型和II型抗原的表達(dá)和多種受體的表達(dá)，如；白介素-2受體（IL-2R）、腫瘤壞死因子-α受體（TNF-αR）、巨噬細(xì)胞膜上的Fc受體； (2)增強(qiáng)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞和ADCC作用的活性； (3)直接作用于B細(xì)胞影響抗體的生成. 在IFN-α治療的早期，病毒產(chǎn)物合成減少與其誘生的抗病毒蛋白有關(guān)，隨后持續(xù)的療效主要與其免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)［4]. 雖然IFN-α的抗病毒作用已經(jīng)被普遍認(rèn)可，但HBeAg 和HBV DNA的陰轉(zhuǎn)率僅比對照組高20%， HBsAg 的陰轉(zhuǎn)率僅比對照組高5～6％［5]. 影響IFN-α應(yīng)答性的因素亦尚不清楚. 研究發(fā)現(xiàn)除宿主方面的因素外，在病毒方面，不同的病毒株對IFN-α有不同的敏感性，多種變異株顯示對IFN-α有特別的抵抗力，HBV準(zhǔn)種的復(fù)雜程度也對IFN-α的應(yīng)答性有影響.現(xiàn)將有關(guān)研究綜述如下；

　　1  HBV基因型對IFN-α應(yīng)答性的影響

　　根據(jù)HBV基因組全序列的差異（>8％），或S基因序列的差異（>4.1%）［6]，HBV基因組可分為7個基因型（A～G）. 不同的基因型存在明顯不同的地域分布和不同的致病能力. A型呈全球性流行，但主要分布在西北歐、北美和中非. B型主要發(fā)現(xiàn)在中國和東南亞. C型主要分布在中國和東亞. D型分布在地中海、中東和印度. E型分布在非洲. F型流行在美洲土著人和波利尼西亞群島. G型是2000年新發(fā)現(xiàn)的基因型，首先發(fā)現(xiàn)在美國亞特蘭大和法國里昂［7]. 在中國，一般認(rèn)為主要的流行型是B型和C型，這與臺灣地區(qū)的流行型相同［8]. 其中，南方以B型為主，北方以C型為主. C型常引起嚴(yán)重的肝臟損害，而B型感染病情較輕但容易引起肝硬化［9]. 除此之外，研究還發(fā)現(xiàn)不同的基因型對IFN-α的應(yīng)答性也不相同. 臺灣學(xué)者Kao et al［10］報(bào)道了58例B型和C型慢性感染患者IFN-α2b治療的結(jié)果，B型和C型的應(yīng)答率分別是41%和15％（P=0.045）. Sangfelt et al［11］用IFN-α治療A～D四種基因型感染的兒童，其中獲得良好應(yīng)答的都是所謂非亞洲型的A和D型. Zhang et al［12］報(bào)道在A、D和E 3個HBV基因型中，A型對IFN-α的應(yīng)答率最高為75％，而D和E型則勻?yàn)?0％. Erhard et al［13］報(bào)道，A、B、C和D四個基因型對IFN-α的應(yīng)答率分別是50%、4%、8%和38%. 另外還有報(bào)道，不同的基因型發(fā)生PreC區(qū)和BCP區(qū)突變的概率不同［14]，已有研究報(bào)道這些區(qū)域的突變對IFN-α的應(yīng)答性有影響. 所感染HBV的基因型不同可能也是我國乙型肝炎容易慢性化和難以治療的原因之一.

　　2  HBV變異對IFN-α應(yīng)答性的影響

　　HBV雖然是DNA病毒，但因其復(fù)制過程的特殊性，HBV的自發(fā)突變率超過其他DNA病毒約4個數(shù)量級［15]. 在過去的10多年中，有關(guān)HBV變異臨床意義的研究一直是熱點(diǎn)之一. 有關(guān)病毒變異對IFN-α應(yīng)答性影響的研究報(bào)道也很多. 由于HBcAg和HBeAg 在機(jī)體免疫應(yīng)答中所起的特殊作用，因此研究主要集中在HBcAg和HBeAg的編碼區(qū)和相應(yīng)調(diào)節(jié)區(qū)的變異. 目前報(bào)道的位點(diǎn)主要有BCP、CURS、NRE、PreC區(qū)、C區(qū)突變和ISRE［16-18］.

　　      BCP（1 742～1 849 nt）、CURS（1 643～1 742 nt）和 NRE（1 611～1 634 nt）均位于X基因區(qū)內(nèi). BCP 和CURS控制3.5kb mRNA轉(zhuǎn)錄，NRE的功能是拮抗BCP 和CURS的作用. 此區(qū)最常見的突變是A1762T和G 1764A. 突變的后果是HBeAg的合成量下降約70％，但HBcAg的合成和病毒前基因組的生成不受影響，病毒的復(fù)制能力增加［19］. Erhard et al［13］研究了這3個區(qū)域的突變對IFN-α應(yīng)答性的影響后發(fā)現(xiàn)；CURS和NRE區(qū)域的突變與IFN-α的應(yīng)答性無關(guān). BCP區(qū)域的突變除A1762T和G 1764A外，重要的還有1753～1766nt區(qū)間的突變（在此區(qū)間聚集有HNF4、和Sp1等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)）. IFN-α的應(yīng)答性與這些突變相關(guān)，但結(jié)果在HBeAg陽性和陰性患者之間截然相反，在HBeAg陽性的患者，IFN-α完全應(yīng)答率與整個BCP區(qū)，特別是與1753～1766nt區(qū)域堿基突變數(shù)成正比（P<0.04，P<0.015）,亦與A1762T和G1764A突變呈顯著相關(guān)（P<0.007）. 在HBeAg陰性的患者，IFN-α完全應(yīng)答率與整個BCP區(qū)，特別是與1753～1766nt區(qū)域堿基突變數(shù)成反比（P<0.04，P<0.02）, 1762nt和1764nt為野生型者應(yīng)答性高（P<0.003）.

　　      PreC區(qū)和C區(qū)突變對IFN-α應(yīng)答性的影響. Pre-C區(qū)突變的研究主要集中在G1896A nt終止突變［20]，C區(qū)突變的研究主要集中在CTL識別表位（HBcAg18～27aa）的變異上［21]. Zhang et al［22］報(bào)道35例成人患者在IFN-α治療后發(fā)現(xiàn)；IFN-α的應(yīng)答應(yīng)性與治療前HBV DNA水平和IFN-α的用量無關(guān). 獲得應(yīng)答者 PreC區(qū)多為野生型，而非應(yīng)答者嚶兄罩雇槐洌í玃<0.002）. Brunetto et al［23］報(bào)道了115例意大利患者的研究，結(jié)果與Zhang的報(bào)道相一致，另外還發(fā)現(xiàn)PreC區(qū)終止突變同時也影響HBV的自然清除，在有PreC區(qū)終止突變病毒感染的患者，自然清除率只有19％，而野生型則高達(dá)47%. 美國學(xué)者Naoumov et al［24］發(fā)現(xiàn)在IFN-α應(yīng)答者中，PreC區(qū)和C區(qū)的錯義突變明顯少于非應(yīng)答者（P<0.001）,并且發(fā)現(xiàn)在非應(yīng)答者中全部存在HBcAg 18～27位氨基酸的替換. Fattovich et al［25］研究發(fā)現(xiàn)IFN-α非應(yīng)答者在C區(qū)內(nèi)B-細(xì)胞和T-細(xì)胞識別表位有更多的氨基酸替換. 提出可根據(jù)C區(qū)的變異預(yù)測患者對IFN-α的應(yīng)答性. 但希臘學(xué)者Alexopoulou et al［26］和日本學(xué)者Shindo et al［27］的研究結(jié)果與上面的報(bào)道完全不同，他們的研究指出HBV PreC區(qū)和C區(qū)突變與患者對IFN-α的應(yīng)答性無關(guān).

　　      ISRE通常存在于IFN-α誘導(dǎo)基因啟動子中的一段序列（AGTTTCNNTTTCNC）. Nakao et al［28］首先在HBV增強(qiáng)子I內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一段相似序列（AGGCTTTCACTTTCTC），同時也在HBV和IFN-α處理過的細(xì)胞核提取物中發(fā)現(xiàn)；IFN刺激因子-3（interferon-stimulated gene factor 3 ，ISGF3）家族的ISGF3-γ（作者命名為p48）能與HBV增強(qiáng)子I內(nèi)這段序列結(jié)合并且抑制了增強(qiáng)子I的活性，這段序列的突變和缺失都會減少IFN-α對HBV的抑制效果. 不過遺憾的是隨后Rang et al［29］和其同事的跟蹤研究并沒有重復(fù)出相同的結(jié)果. 這片段序列的改變是否會影響對IFN-α的應(yīng)答性尚需進(jìn)一步研究.

　　3  HBV準(zhǔn)種復(fù)雜性對IFN-α應(yīng)答性的影響

　　病毒的準(zhǔn)種（quasispecies）特性及其臨床意義近來受到了越來越多的關(guān)注. 準(zhǔn)種是復(fù)雜的、處于動態(tài)分布的彼此相關(guān)但又不完全相同復(fù)制子的集合（準(zhǔn)種各成員之間，其差異程度一般不超過核苷酸總長度的2～5％）. 這是Eigen最早用于描述地球上早期生命形式的一個理論模型. 準(zhǔn)種包括一個或幾個主導(dǎo)序列（master sequence）和一個變異譜（mutant spectrum）. 主導(dǎo)序列是群體中的最適序列，他可與共有序列（consensus sequence）一致，亦可能不同. 復(fù)制的忠實(shí)性決定著突變譜的大小. 整個集合共同處于環(huán)境的選擇壓力之下維持著動態(tài)平恒. 準(zhǔn)種理論與以前的群體生物學(xué)理論最大的區(qū)別是；不認(rèn)為野生型是一個有明確核酸序列的單獨(dú)的基因組，而是多種密切相關(guān)基因組構(gòu)成的一個整體［30］. 在病毒學(xué)領(lǐng)域，目前準(zhǔn)種的研究主要集中在RNA病毒，因?yàn)镽NA病毒變異大，復(fù)制快，在很短的時間內(nèi)感染個體中即可形成一個彼此密切相關(guān)的異質(zhì)性病毒群體. 研究最多的是HCV和HIV. 病毒的準(zhǔn)種特性實(shí)質(zhì)上是其進(jìn)化的一種生存優(yōu)勢，病毒最大限度地"制造"自己的大量變異序列，這些序列中可能包括了潛在有用的變異體，如對抗病毒制劑有抵抗能力、能逃避CTL攻擊和誘導(dǎo)免疫耐受的突變體. 這樣當(dāng)環(huán)境改變后病毒可以快速的作出反應(yīng)，從而保證其在宿主體內(nèi)的生存. 最近的研究還發(fā)現(xiàn)病毒準(zhǔn)種象人體免疫系統(tǒng)一樣具有記憶能力［31]，當(dāng)準(zhǔn)種再次遇到經(jīng)歷過的環(huán)境作用時，保存在突變譜內(nèi)的少量病毒株將迅速大量復(fù)制成為準(zhǔn)種的主導(dǎo)序列.因此如果病毒準(zhǔn)種的復(fù)雜性越大，治療難度就可能越大. 在HCV的研究中已發(fā)現(xiàn)，病毒準(zhǔn)種的異質(zhì)性越大，對IFN-α的應(yīng)答性就越差［32].有學(xué)者提出作為DNA病毒的HBV也存在準(zhǔn)種特性. 已有少量的研究報(bào)道證實(shí)了這種假說［33]，有關(guān)HBV準(zhǔn)種復(fù)雜性與IFN-α應(yīng)答性之間相關(guān)性研究尚未見報(bào)道. 從我們最近的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HBV不僅存在準(zhǔn)種特性，且在慢性乙型肝炎中準(zhǔn)種的復(fù)雜性和異質(zhì)性還很大. 同時也發(fā)現(xiàn)，在IFN-α應(yīng)答的患者中，準(zhǔn)種的復(fù)雜性明顯小于非應(yīng)答患者，這與在HCV的研究發(fā)現(xiàn)相一致.

　　      總之，可見HBV的遺傳異質(zhì)性對IFN-α應(yīng)答是有影響的. 然而，過去很多研究僅根據(jù)從患者血清中分離出的單個或少數(shù)幾個病毒株或基因片段來判斷某一變異株對IFN-α治療的影響，這是不準(zhǔn)確的，因?yàn)樗麄儍H僅窺視了病毒準(zhǔn)種的少數(shù)成分，慢性乙型肝炎患者血中HBV DNA拷貝數(shù)常在百萬至十億之間，隨機(jī)抽取單個或少數(shù)幾個克隆株不可能代表其準(zhǔn)種組成，所以難免得到一些彼此矛盾的研究結(jié)果. 分析HBV對IFN-α應(yīng)答性的影響，必須注意到病毒的準(zhǔn)種特性. 在我國大多數(shù)的HBV感染者是通過母嬰垂直傳播感染的，大多經(jīng)過了一個很長的感染期，部分患者還可能已經(jīng)接受過多種/多次的抗病毒治療. 在其體內(nèi)早已形成了一個復(fù)雜的異質(zhì)性的病毒群體，因此對HBV準(zhǔn)種特性的研究顯得尤其重要. 準(zhǔn)種理論與既往群體生物學(xué)理論的最大差別是；不再把野生型看成一個有確定核酸序列的單個基因組，而看成一群密切相關(guān)基因組構(gòu)成的一個整體. 準(zhǔn)種理論最大的特點(diǎn)是；從患者體內(nèi)整個病毒群體水平上去認(rèn)識病毒的生物學(xué)特性及臨床意義，不再注重某種單個的野生型或變異株的作用. 準(zhǔn)種理論指導(dǎo)我們從一個全新的方式去認(rèn)識HBV的生物學(xué)特性及臨床意義. 通過對HBV準(zhǔn)種生物學(xué)特性以及HBV準(zhǔn)種的形成與急性HBV感染的慢性化、慢性HBV感染的臨床轉(zhuǎn)歸之間的相互關(guān)系的深入研究，可能為探索抗HBV感染的治療方法提供重要線索.

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