拉米夫定治療慢性乙型肝炎耐藥性的基礎與臨床研究

　　摘要

　　拉米夫定(lamivudine)是核苷類似物, 對乙型肝炎病毒(HBV)的復制有很好的抑制作用. 其主要抗病毒機制是抑制HBV多聚酶的逆轉錄酶活性, 有效阻止病毒核酸的復制合成. 拉米夫定因其具有迅速抑制HBV復制, 降低病毒載量, 促進HBeAg血清轉換, 改善肝組織炎癥壞死病變, 延緩肝纖維化進程作用, 以及良好的耐受性、安全性和服用方便等特點, 已廣泛應用于臨床. 雖然總體上不良反應發生率較低, 但是在臨床繼續應用的幾年后遇到了越來越多的治療問題, 尤其是拉米夫定治療慢性乙型肝炎的耐藥性問題. 現對拉米夫定治療慢性乙型肝炎的作用機制、耐藥性產生及發生機制、HBV產生耐藥性的分子病毒學基礎、YMDD變異株的生物學特性及YMDD變異對病情的影響等作了系統全面的闡述, 并就預防和處理耐藥性問題提出了應對策略, 對拉米夫定聯合用藥等問題作了回顧與展望.

　　關鍵詞: 慢性乙型病毒性肝炎; 拉米夫定; 耐藥性; YMDD/YIDD變異; 對策

　　0 引言

　　1995年Dienstag et al[1]發現, 拉米夫定(lamivu-dine)對HBV DNA的抑制作用以來, 世界各地先后進行了拉米夫定治療乙型肝炎的Ⅱ期和Ⅲ期臨床試驗. 拉米夫定作為第一個獲美國食品藥品管理局(FDA)批準的口服抗乙型肝炎病毒(HBV)藥物, 其問世推動了慢性乙型病毒性肝炎(CHB)治療的進程[2]. 拉米夫定因其具有迅速抑制HBV復制, 降低病毒載量, 促進HBeAg血清轉換, 改善肝組織炎癥壞死病變, 延緩肝纖維化進程作用, 以及良好的耐受性、安全性和服用方便等特點, 已廣泛應用于臨床[3]. 雖然總體上不良反應發生率較低, 但是在臨床繼續應用的幾年后遇到了越來越多的治療問題, 尤其是拉米夫定治療慢性乙型肝炎的耐藥性問題[4]. 拉米夫定(lamivudine, 化學名稱: 2'''''''', 3''''''''-二脫氧-3''''''''-硫代胞嘧啶, 簡稱LAM, 3TC)為雙脫氧核苷類似物, h, 藥物清除率22.61/h. h), 絕對生物利用度達86%-88%, 平均半衰期8.41-9.11 口服吸收快(平均吸收時間1.32 拉米夫定在體內轉化為三磷酸拉米夫定后對HBV有更強的抑制作用. 拉米夫定最后大部分以原形由腎臟排泄, 可通過胎盤及血腦屏障. 拉米夫定是逆轉錄酶抑制劑, 最初用于治療HIV感染, 以后發現對于HBV復制具有抑制作用. HBV侵入肝細胞后, 在HBV DNA多聚酶(DNAP)作用下, 先形成共價閉合環狀DNA (cccDNA), 然后以cccDNA為模板轉錄病毒前基因組, 再借助HBV DNAP以前基因組為模板合成負鏈, 繼而合成正鏈. cccDNA存在于感染細胞核內, 是HBV DNA復制的模板, 不受藥物的影響. 拉米夫定的作用靶點是HBV的RNA指導的DNA聚合酶(RDDP). 該藥可與DNA合成所需的底物三磷酸脫氧核苷酸(dNTP)競爭RT上的結合位點, 結合到DNA鏈上起到鏈終止作用, 在體內選擇性抑制HBV DNAP活性, 競爭性抑制病毒的逆轉錄過程, 從而抑制病毒復制[5]. 但是由于他不能清除肝細胞內病毒的cccDNA, 未達到血清轉換, 停藥后HBV DNA又可再度復制.

　　1 拉米夫定耐藥性及發生機制

　　1.1 耐藥性發生率 a以后, 并且隨時間的延長不斷增多 目前的研究證實, HBV拉米夫定耐藥變異常發生在治療0.5[6]. a時, 變異發生率分別為15% 臨床研究數據顯示, 拉米夫定治療1, 2, 4[7], 38%[8]和67%[9]. 隨著治療時間的延長, 耐藥率明顯增加. 近已觀察到有些拉米夫定再治療患者發生耐藥突變的時間相對提前. 因變異株復制能力明顯低于原型株, 變異時HBV DNA水平仍低于治療前, 但可伴暫時性ALT升高, 臨床上有輕度乏力、惡心等表現. Atkins et al[10]用拉米夫定治療時16%-32%有YMDD變異, wk時, 但80%可消失. 變異者的HBV DNA可持續陽性, 其中24%的患者ALT升高達3倍以上, 但組織學仍有改善, 變異最早可發生于治療36 mo后變異株可被原株取代, 從而出現HBV DNA“陽轉”現象. 治療前HBV DNA水平高, 表明繼續治療仍有效. 當停止治療3-4 HBeAg陽性者易有“陽轉”的趨勢, HBV DNA“陽轉”時可伴ALT升高. 再次用拉米夫定治療仍可有效, 但變異會再次更快地產生[11].

　　1.2 發生機制 拉米夫定單用治療CHB可以誘導體內病毒學和生化反應血清的復常, a內會出現拉米夫定耐藥突變. 肝組織學的改善, 但同時也導致了拉米夫定耐藥突變的產生, 超過50%的患者治療3 早期研究認為耐藥的HBV突變引起的是病毒復制的減弱, 從而致病性也隨之減弱, 但隨后的研究表明不完全受抑制的HBV復制否定了原先的假設. 耐藥突變的病毒通過適應選擇出逐步復制活躍的致病性較強的病毒種類, 并且賦予了HBV以復雜的免疫應答反應, 而臨床發現這樣的突變確實帶來較強的致病性: 拉米夫定的耐藥性導致了HBeAg陽性患者體內產生低血清轉換率, 低度的病毒學和生化反應, 不顯著的組織學改變等, 突變株對拉米夫定敏感性降低, 病情出現反復, 甚至失效[12]. 目前認為, HBV對核苷類似物耐藥性的產生與HBV P基因變異有關, 并且HBV P基因變異是多位點的, 以C區YMDD基序的變異最為重要. 拉米夫定耐藥突變定位于HBV DNA多聚酶逆轉錄酶結構域上酪氨酸-蛋氨酸-天門冬氨酸-天門冬氨酸(YMDD)模序上的突變[13]. YMDD位于C區第549-552aa (即Y549M550D551D552), YMDD中蛋氨酸(M)被纈氨酸(V)或異亮氨酸(I)替代, 變成YVDD或YIDD[14]. 使用新的命名法, 拉米夫定相關的HBV耐藥株的變異位置和類型為rtM204I/V (C區)±rtL180M (B區). 最近, 還發現一種新的變異類型, mo的患者的血清中發現的, 即YSDD變異或rtM204S變異(以往報告的基本是YVDD或YIDD變異), 這種變異株是從1例接受拉米夫定治療18 體外轉染研究也證實了這種YSDD變異株對拉米夫定耐藥. HBV YMDD基序變異引起對拉米夫定耐藥的機制: YMDD變異可引起HBV DNAP空間構象發生改變, 進而引起其與拉米夫定之間的作用發生改變, 與dNTP或拉米夫定的結合力下降. 根據HBV野毒株和YMDD變異株聚合酶的酶學分析和模擬的HBV聚合酶晶體結構特點, 發現YMDD是HBV DNAP的催化位點, 當M變為I或V時可導致氨基酸側鏈的柔性減低, 并在HBV DNAP和拉米夫定三磷酸鹽之間形成空間位阻, 與拉米夫定三磷酸鹽的結合力下降[15]. 拉米夫定治療表現出機體CD4+和CD8+ T細胞針對HBV抗原的反應的加強. Lin et al[16]認為一個CD8+ T細胞針對拉米夫定耐藥多聚酶抗原表位的反應影響了機體對拉米夫定的反應. 他們解釋了特異性T細胞的功能和表現型并表明功能性的抗-YMDD細胞毒性T淋巴細胞(CTL)與之反應和結果相關, 并強調了HBV DNAP催化部位非多肽YMDDVVLGA(氨基酸序列203-211)中逆轉錄酶結構域中的YMDD模序是一個限制性的CTL抗原表位.

　　1.3 分子病毒學基礎 大多數生物能夠通過復雜的機制來維持其遺傳信息的穩定性, 而病毒卻相反, 他們處于快速和持續的基因變異之中. HBV在復制過程中盡管產生大量的子病毒, 但并不直接殺傷被其感染的肝細胞. 由于HBV的復制所需的HBV DNA多聚酶是一種逆轉錄酶, 缺乏校正的功能, 因此HBV變異率高于其他DNA病毒10倍左右, 變異的頻率約為(1.4-3.2)×10-5核苷酸替換/位點/a. 從理論上講, 對于任何核苷類HBV藥物, HBV均有耐藥株的可能性, 所不同的是出現時間早晚的差異. 變異病毒的復制必須有可用的復制空間, 變異株是通過占據原來野毒株的位置而獲得復制空間的, 此過程的前提是原來野毒株的消失, 而原來野毒株能否消失又受其本身的復制適應性、肝細胞的更新、增殖等影響. 所以只有在擁有新的復制空間的前提下, HBV耐藥株在肝內的數量才會增加. 在所施加的藥物選擇壓力撤銷后(如停用拉米夫定), 原來的野毒株是否重新出現、出現的時間以及能否成為優勢株, 同樣取決于是否還存在野生株及其所占復制空間的大小[17]. 同時HBV存在若干個血清型, 根據表面抗原具有兩對相互排斥的抗原決定簇d, y, w, r, 以及表面抗原的共同抗原決定簇a, 可將HBV分出9個基本血清型, 常見的有adw, adr, ayw和ayr. 但研究表明, 血清型的劃分不能完全反映其核酸變異程度. 根據HBV全基因核苷酸序列異源性≥8%或者S基因區核苷酸序列異源性≥4%, 將不同病毒株分為不同的基因型[18]. 迄今為止HBV可以分為8個基因型[19-20], 即A, B, C, D, E, F, G和H. B基因型和C基因型之間還可能發生重組[21]. 但HBV基因型與拉米夫定療效間的關系目前尚未有明確定論, Kao et al[22]發現, B基因型的HBeAg血清轉換率高于C基因型, Zollner et al[23]研究了26例CHB患者對LAM的應答, 發現在adw亞型(主要為基因型B)的患者中, LAM耐藥的發生率是其他亞型的20倍, Chien et al[24]發現, 基因型C的HBeAg復發率顯著高于基因型B. 而Chan et al[25]卻認為, CHB患者接受拉米夫定治療后HBeAg的血清轉換率與HBV基因型無關.

　　2 YMDD變異株

　　2.1 生物學特性 過去認為和野毒株相比, YMDD變異株的復制能力顯著降低. 體外YMDD變異株不能像野生型HBV那樣有效復制, 復制能力明顯下降. 臨床上也發現, 發生YMDD變異者在停用拉米夫定之后, 患者體內的變異株常常很快被野毒株所取代, 提示YMDD變異株存在復制缺陷[26]. Liu et al[17]認為, 拉米夫定治療后, HBV DNA載量顯著下降, 能容納新的HBV cccDNA的肝細胞增加, 當與野生株密切相關的YMDD變異株出現(自然存在或拉米夫定治療后出現的少量變異株)由于不存在藥物的選擇壓力而在肝細胞中迅速復制, 從而引起HBV DNA突發. 近年來, 隨著對YMDD變異株研究的進一步深入, 發現并不是所有YMDD變異株均存在復制缺陷, HBV YMDD變異株的復制能力并非均減弱[27]. 最近發現YMDD變異伴“a”決定簇內變異時, 患者可出現病情惡化, 體外研究結果顯示, 這種聯合變異可使病毒的復制能力明顯增強, 與以往的研究結果不一致. 還有研究也提示, HBV DNA多聚酶rtLl80M (B區)變異可補償HBV YMDD變異株的復制缺陷, 使HBV的復制增強. 其他學者的研究也證實, YMDD基序之外的變異可補償YMDD變異株的復制缺陷. 臨床研究也發現某些YMDD變異株可能具有較強的復制能力. 有人報道, 在臨床上已發現YMDD變異株引起的急性HBV感染. 并且對YMDD變異株的消長狀態進行監測發現, 停用拉米夫定之后, 體內的YMDD變異株可存在數月之久. YMDD變異株借助YMDD基序之外的變異補償HBV復制缺陷的假設, 可以解釋臨床上有些患者出現變異后高于治療前水平的HBV DNA滴度. 這也可能是某些YMDD變異者病情加重的原因之一.

　　2.2 對病情的影響 YMDD突變后患者的臨床表現形式多樣, 最初表現為血清HBV DNA水平下降或陰轉后繼續治療時陽轉或明顯上升, 部分患者可無臨床癥狀、ALT正常, 類似免疫耐受; 也有部分患者出現肝炎發作, ALT水平升高. 對臨床表現輕微的患者繼續拉米夫定治療, 大多數仍可獲益. 但也有少數患者, 特別是肝臟儲備下降的患者如肝硬化及肝功能失代償者, 在繼續拉米夫定治療后病情急性加重[28-29], 應引起臨床重視. 拉米夫定相關變異株引起病情急性加重的機制尚不清楚, 肝臟病變基礎和肝功能的代償能力可能是重要的影響因素, 應進一步加強對臨床表現及治療的研究[30]. 關于突變株出現后患者肝功能的改變, 目前的結論不盡相同. 有學者認為, 出現YMDD基序的變異, 伴有對拉米夫定耐藥, 表現為HBV DNA滴度升高, 伴有肝酶升高, 但升高的水平低于治療前的水平, 肝組織病理結果與變異株出現前沒有惡化, 與沒有抗藥性的患者的組織學表現相似[31]. 目前認為, 發生YMDD變異患者繼續使用拉米夫定治療, 其肝組織學的改善優于安慰劑組. 所以, 變異株出現后仍可繼續治療. 因為停止治療后, 野毒株將重新成為優勢株, 而變異株的DNA復制水平低于野毒株, 肝功能的損害也較野毒株輕[32-33]. 體外研究指出, YMDD變異株并不像野毒株那樣有效地進行復制.

　　3 預防和處理

　　3.1 嚴格拉米夫定治療的適應證 拉米夫定不能濫用, 必須選擇適應證. 基礎病毒水平過高或免疫耐受的患者常需長期應用拉米夫定, 耐藥變異的發生率很高[34]mo后, 需密切觀察, . 選用拉米夫定治療6 mo以內反復增高, mo, 或6 定期檢測YMDD和病毒定量. 目前認可的拉米夫定治療的適應證為: (1)ALT≥2×正常值上限(ULN), 并持續增高至少1 建議實施治療; (2)ALT水平在1-2×ULN之間, 建議根據患者具體情況(如肝活檢結果等), 權衡利弊, 決定是否實施治療; a; (3)可以應用于失代償期肝硬化合并HBV DNA陽性或/和HBeAg陽性的患者; (4)有抗病毒指征的慢性乙型肝炎患者, 療程至少1 (5)針對不同的患者應該采用個體化療法. YMDD發生變異后仍繼續用拉米夫定治療的患者, 如發現血清病毒水平明顯增高和/或血清轉氨酶增高, 應停藥改用其他治療. 發現YMDD后停藥的患者, 需密切觀察, 警惕停藥后病情急性加重. 出現耐藥突變后伴有病情加重時, 建議在加強綜合治療措施同時, 采取積極有效的方法, 如改用或聯合阿德福韋治療[35]mo后開始檢測, 如野毒株轉換, 可再用拉米夫定治療, 但可能再次變異, 且發生較早. . 3 一般發現耐藥變異后需換用其他抗病毒藥物. 野毒株轉換后重新用拉米夫定, 最好與其他藥物聯合治療[36].

　　3.2 拉米夫定聯合用藥的問題 由于目前抗HBV的藥物療效有限, 聯合治療和個體化治療一直是大家關注的問題, 很多學者都認為今后的發展方向為聯合治療, 但目前美國、歐洲、亞太肝病專家3個國際會議的共識建議中均未提到聯合治療的方案, 主要由于目前臨床研究資料還不夠充分. 目前較多報道為干擾素和拉米夫定聯合應用, 尚未獲得肯定結論. 盡管現有資料尚不能反映聯合治療的優勢, 但不同作用機制的藥物聯合治療仍是今后研究的方向. 為何抗HBV的藥物聯合治療不像其他疾病那樣獲得良好療效? 也是日后研究的重點[37]. 個體化治療將是決定治療效果的關鍵, 包括不同基因型對干擾素治療應答有差異, 免疫狀態和治療的關系等. 拉米夫定聯合其他作用位點不同的核苷類似物[38]、免疫調節劑[39]、干擾素[40]等的治療方案尚在探索之中. 理論上聯合用藥能降低耐藥性產生, 有更高的反應率, 能使體內病毒量下降更多, 但實際作用還有待廣泛的臨床研究證實. Leung et al[41]a內64%的患者HBeAg陰轉, ALT復常率100%, 聯合拉米夫定、泛昔洛韋、胸腺素治療CHB, 1 治療后所有患者血清HBV DNA均陰轉. 值得指出的是, 體外實驗中, 2'''''''', 3''''''''-二脫氧胞苷、脫氧胞苷以及2'''''''', 3''''''''-二脫氫-2'''''''', 3''''''''-二脫氧胸苷可明顯抑制拉米夫定的磷酸化過程[42], 故聯合應用核苷類似物時應考慮到藥物間的相互作用. Rigopoulou et al[43]應用拉米夫定聯合IL-12治療, 觀察患者體內病毒學反應和免疫應答也收到了良好的效果. 我們在相關的研究中發現免疫調節劑胸腺肽α1能夠改善患者的免疫功能, 其與拉米夫定、干擾素或其他抗病毒藥物的聯合使用都表現出良好的治療效果[44].

　　總之, 遺傳和變異是生物界普遍現象, 病毒結構簡單和增殖速度較快使其更易變異, 這種變異可自發或誘導, 對外界壓力干預產生反抗, 結果是耐藥生存. 因此, 拉米夫定治療CHB出現耐藥性是完全符合客觀規律的. 最近有研究表明, 在15%-25%未曾用過拉米夫定治療的CHB患者的血液中存在YMDD變異株, 實際上YMDD變異出現并非應用拉米夫定所特有[45]. 拉米夫定自上市以來雖然其耐藥性成為其繼續推廣應用的一個問題, 但這個問題正在不斷地得到解決. 拉米夫定治療CHB的療效和HBV變異株的出現是目前臨床關注的熱點[46]. 拉米夫定長期治療耐藥毒株產生幾率增加和短期治療大多數患者回復到治療前狀態, 是難以解決的矛盾. YMDD變異對病毒復制、ALT反跳和臨床癥狀的影響, 報道結果不盡相同, 其原因可能與人體免疫功能狀態及病毒復制水平相關. 而停藥后出現的病情急性加重也提示, 應加強對拉米夫定治療的審慎選擇. 總之, 拉米夫定是CHB的重要治療措施, 但也存在YMDD變異致耐藥性的產生. 治療中采用其他藥物替代或聯合其他藥物治療, 可避免耐藥突變的產生, 但迄今尚無確切有效的HBV耐藥性變異株的治療方法[47-48].  有關拉米夫定耐藥性的分子生物學研究和應用拉米夫定的聯合治療方案及療效尚待進一步探索.

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