扁平苔蘚皮損中腫瘤壞死因子表達(dá)

    腫瘤壞死因子 （TNF- ）是腫瘤壞死因子超家族的重要成員，可通過死亡受體途徑促使靶細(xì)胞凋亡，近年研究證實，扁平苔蘚的發(fā)生與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，我們通過檢測死亡受體途徑中TNF- 和下游關(guān)鍵分子半胱氨酸冬氨酸蛋白酶8（Caspase-8）和Caspase-3在扁平苔蘚皮損中的表達(dá)。探討其在扁平苔蘚皮損發(fā)病中的作用。 

    材料與方法 
    一、 對象 
    收集我院皮膚科20例扁平苔蘚患者皮損，男13例，女7例，年齡41~73歲，平均39.4歲均經(jīng)臨床和病理共同確診，同時半年內(nèi)未使用過糖皮質(zhì)激素和那樣抑制劑類藥物。健康對照組20例，取自整形科健康人皮膚，男11例，女9例，年齡32~67歲，平均36.8歲。兩組性別和差異無統(tǒng)計學(xué)意義。所有組織均制成石蠟標(biāo)本備用。 

    二、試劑 
    兔抗人TNF- 多克隆抗體、兔抗人Caspase-8多克隆抗體、兔抗人Caspase-3多克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；即用型二步法檢測試劑盒PV-9000（美國GBI公司），二氨基聯(lián)苯胺（DAB）試劑（美國Sigma公司）；TUNEL試劑盒（美國Roche公司）。 

    三、 方法 
    1、免疫組化法：石蠟切片脫蠟至水化；3% 溶液消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。分
別滴加TNF- 、Caspase-8和Caspase-3多抗（滴度分別為1:150,、1:250和1:100），TNF- 、Caspase-8采用已知陽性乳腺癌組織作陽性對照；Caspase-3采用正常扁桃體作陽性對照；磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作陰性對照，再滴加二步法試劑PV-9000。以上各步驟均采用PBS沖洗5min共3次。DAB顯色，蘇木素復(fù)染、脫水封片。

    2、凋亡檢測法：石蠟切片脫蠟至水化，過0.3% 甲醇。滴加蛋白酶K工作液，37 孵育30min；滴加新鮮配置的TUNEL反應(yīng)液，37 孵育60min，以只含標(biāo)記dUNEL反應(yīng)液作陰性對照；加過氧化物酶轉(zhuǎn)化劑（POD），37 孵育30min。以上各步驟均采用PBS沖洗5min共3次。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水封片。 
    3、結(jié)果判斷：免疫組化結(jié)果以胞質(zhì)或胞核著棕黃色為陽性細(xì)胞，采用MIAS-2000圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析，用積分廣密度值（integrated optical density,IOD）代表每張切片的陽性表達(dá)強度，每張切片隨機測定5個高倍視野（×400），取平均值，用 ±s表示。凋亡檢測結(jié)果以胞核著棕黃色為凋亡細(xì)胞百分比，取平均值為最終凋亡指數(shù)（apoptosis index,AI），用 ±s表示。 
    4、統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件分析，組間比較采用成組t檢驗。指標(biāo)間相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析，以 =0.05為檢驗水準(zhǔn)。 

    結(jié)果 
    一、 免疫組化結(jié)果 
    TNF- 、Caspase-8陽性染色定位于胞質(zhì)，Caspase-3陽性染色定位于胞質(zhì)或胞核。扁平苔蘚組TNF- 、Caspase-8和Caspase-3陽性細(xì)胞主要位于表皮基底層和棘層，表達(dá)慢性增強，真皮淺層淡性細(xì)胞也有少量表達(dá)；健康對照組三者僅在部分標(biāo)本的基底層偌陽性表達(dá)。兩組間IOD均值比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。 

    二、凋亡檢測結(jié)果
扁平苔蘚組表皮和真皮淺層散在分布凋亡細(xì)胞，主要位于基底層和棘層，特別是基底液化區(qū)域更集中，部分表皮全層均可見大量凋亡細(xì)胞；健康對照組僅顆粒層有少量凋亡細(xì)胞。扁平苔蘚組AI值明顯高于健 康對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。 

    三、相關(guān)性分析 
    扁平苔蘚患者TNF- 、Caspase-8的表達(dá)強度與其角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡指數(shù)間均呈正相關(guān)，r分別為0.72、0.75，P值均<0.01；同時兩者與Caspase-3的陽性表達(dá)也均呈正相關(guān)r分別為0.78、0.73，P值均<0.01。 

    討論 
    扁平苔蘚是一種原因不明確的累及皮膚黏膜的炎性丘疹鱗屑性疾病，其發(fā)生與細(xì)胞凋亡有關(guān)。我們運用TUNEL法檢測扁平苔蘚皮損中細(xì)胞的凋亡情況，發(fā)現(xiàn)扁平苔蘚皮損中角質(zhì)形成的細(xì)胞凋亡明顯增多，與文獻(xiàn)報道結(jié)果完全一致，且凋亡主要其中于表皮基底層和棘層，在基底液化區(qū)域尤為明顯，故推測細(xì)胞細(xì)胞過渡凋亡可能在促進(jìn)皮損處基底細(xì)胞液化變化中啟到一定的作用。細(xì)胞凋亡時，DNA斷裂早于DNA含量和細(xì)胞形成的改變，而TUNEL法正是以檢測凋亡細(xì)胞的DNA斷裂點來判斷細(xì)胞凋亡，所以此法可以檢測到處于凋亡早期的細(xì)胞，所以在部分扁平苔蘚表皮各層發(fā)現(xiàn)有大量凋亡細(xì)胞。 

    Caspase分子的級聯(lián)反應(yīng)在凋亡過程中起著重要的介導(dǎo)作用，其中Caspase-3是凋亡反應(yīng)中重要的執(zhí)行者，無論是死亡受體途徑還是線粒體途徑都需要激活Caspase-3才能引發(fā)凋亡，所以Caspase-3常被作為判斷凋亡的指標(biāo)。本研究顯示，扁平苔蘚中Caspase-3陽性細(xì)胞主要分布于表皮，間接提示表皮細(xì)胞凋亡過度，與TUNEL檢測的凋亡結(jié)果基本吻合。
TNF- 在體內(nèi)人來源廣泛，與其受體TNFRI結(jié)合，通過活化一系列信號傳導(dǎo)因子，激活Caspase-8、3等分子，來引起靶細(xì)胞凋亡，其中Caspase-8是凋亡反應(yīng)中是最重要的啟動者，不僅參與死亡受體途徑，也可以啟動線粒體途徑，進(jìn)一步放大凋亡信號。 

    扁平苔蘚表皮中TNFRI表達(dá)上調(diào)，靠近基底層表達(dá)水平更高。本實驗顯示，扁平苔蘚皮損中TNF- 和Caspase-8表達(dá)上調(diào)，強度一致，TNF- 表達(dá)情況與丁政云等的報道結(jié)果吻合。我們還發(fā)現(xiàn)，兩者表達(dá)強度均與皮損中角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡指數(shù)和Caspase-3的表達(dá)呈正相關(guān)，且二者陽性細(xì)胞和凋亡細(xì)胞都是主要位于表皮基底層和棘層，提示扁平苔蘚中角質(zhì)形成細(xì)胞和淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的TNF- 與角質(zhì)形成細(xì)胞表面的TNFRI結(jié)合，通過激活角質(zhì)形成細(xì)胞中Caspase分子級聯(lián)反應(yīng)引起其凋亡。另外TNF- 還可以誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞向真皮淺層大量浸潤，加重了炎癥反應(yīng)，促進(jìn)病情發(fā)展，如阻止TNF- 釋放，抑制其活性，可能成為治療扁平苔蘚的新靶點。
（王娟，白莉，扁平苔蘚皮損中腫瘤壞死因子 和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8、3的表達(dá)[J] 中安皮膚科雜志2012年12月第45卷第12期）

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