慢性蕁麻疹患者相關(guān)性研究

    慢性蕁麻疹（chronic urticaria）病因復(fù)雜，部分患者發(fā)病與自身免疫有關(guān)，但具體機(jī)制尚未完全明確。有研究表明，慢性蕁麻疹患者血清中補(bǔ)體參與了嗜堿粒細(xì)胞或肥大細(xì)胞組胺釋放、白三烯等炎癥介質(zhì)活化過(guò)程，紅細(xì)胞補(bǔ)體受體是1（complement receptor type1，CR1）即紅細(xì)胞C3b/C4b受體，是補(bǔ)體受體中的重要成員，亦是紅細(xì)胞天然免疫的重要基礎(chǔ)。我們檢測(cè)了慢性慢性蕁麻疹患者和健康人外周紅細(xì)胞CR1及IgE、 C3、C4和CH50的含量，初步探討紅細(xì)胞天然免疫在慢性蕁麻疹的表達(dá)與健康對(duì)照組是否存在差異。 

    對(duì)象與方法 
    2010年6月至2011年6月在廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院皮膚性病科門(mén)診就診的慢性蕁麻疹患者59例，其中人工劃痕癥14例，慢性特發(fā)性蕁麻疹45例；男39例，女29例，平均年齡34.3（18~45）歲。入選標(biāo)準(zhǔn)：患者1周內(nèi)未使用過(guò)抗阻胺藥物，1個(gè)月內(nèi)未用過(guò)糖皮質(zhì)激素及其他免疫抑制劑；無(wú)濕疹、接觸性皮炎、過(guò)敏性皮炎等過(guò)敏性疾病病史；近期無(wú)局部及全身感染。另選本院健康體檢者全血29例，其中男16例，女13例，平均年齡36.2（20~50）歲。兩組間性別、年齡分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本實(shí)驗(yàn)已經(jīng)廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)。 

    二、主要試劑盒儀器 
    FACS Calibur流式性別儀（美國(guó)Becton Dickinson公司），雷杜RT—6000酶標(biāo)儀（上海伍可工貿(mào)有限公司），CX4貝克曼全自動(dòng)化分析儀（美國(guó)Beckman Coulter公司），鼠抗人CR1（CD35）單克隆抗體、免抗屬I(mǎi)gG—FITC（圣克魯斯生物技術(shù)上海有限公司），CH50 ELISA試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。 

    三、方法 
    1、標(biāo)本采集及處理：研究對(duì)象均于早晨空腹菜跗
靜脈血5ml，其中3ml全血放于肝素抗凝管中，4 °c冰箱保存，待流式細(xì)胞儀檢測(cè)；另2ml置于干燥管中，2500r/min低溫離心15min,，吸取上清液，置于-20°c保存待檢。 
    2、CR1表達(dá)檢測(cè)：10µl抗凝血用磷酸鹽緩沖液（PSC）作1:200稀釋后，在干凈的微量離心管中加入1mlPSB、20µl一抗（鼠抗人CR1抗體）、100µl、稀釋的抗凝血，37°c乳育30min，1000r/min離心40min。棄上清液，用PBS洗滌離心3次，在沉淀的紅細(xì)胞中加入1mlPBS及20µl二抗（兔抗鼠IgG—FITC），37°c乳育30min。洗滌3次后加入PBS1ml，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)10000個(gè)紅細(xì)胞表面的熒光強(qiáng)度。 
    3、血清CH50測(cè)定：取血清分離后上清夜，96孔酶標(biāo)板每孔加入稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品50µl于反應(yīng)孔、血清10µl于反應(yīng)孔內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)孔按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。輕輕振蕩搖勻，37°c溫育1h。洗滌5次后加酶標(biāo)抗體每孔50µl，37°c溫育30min后洗滌5次。加入顯色劑避光顯色15min。在45nm處測(cè)定各孔的A值，并由酶標(biāo)儀軟件讀出濃度值。濃度×稀釋倍數(shù)即為樣本CH50的含量。 
    4、血清IgE及C3\C4測(cè)定：采取雙抗體夾心ELISA法。 

    四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 
    采用CPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包，健康對(duì)照組、人工劃痕癥組與慢性特發(fā)性蕁麻疹組三組間樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），健康對(duì)照組與慢性蕁麻疹組三組間均數(shù)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。相關(guān)分析采用Pearson。
結(jié)果 
    一、 外周血紅細(xì)胞CR1的表達(dá) 
    健康對(duì)照組與慢性特發(fā)性蕁麻疹組、人工劃痕癥組間外周血紅細(xì)胞CR1的表達(dá)行one-way ANOVA分析，F(xiàn)=10.19，P=0.01，3組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.01）。健康對(duì)照組與慢性蕁麻疹組間獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，t=4.10，p＜0.01。 

    二、 外周血IgE水平檢測(cè) 
    健康對(duì)照組與人工劃痕癥組、慢性特發(fā)性蕁麻疹組外周血IgE水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，人工劃痕組與慢性特發(fā)性蕁麻疹組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 

    三、 慢性特發(fā)性蕁麻疹血清IgE總C3、C4和CR1的相關(guān)性分析
將慢性特發(fā)性蕁麻疹患者按IgE含量分為3組，IgE<240µg/L組22例，其中CR1為24.45±10.83；IgE240~500µg/L組20例，CR1為33.09±11.86。采用one-way ANOVA分析，F(xiàn)=3.94，P<0.05;LSD法進(jìn)行兩兩比較，IgE<240µg/L組與>500µg/L CR1組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.01）。慢性蕁麻疹患者血清總IgE與CR1呈顯著,正相關(guān)（r=0.27，P<0.05），CR1與血清C3（r=0.16）、C4（r=-0.08）無(wú)顯著相關(guān)性（P值均>0.05），C3與C4呈正相關(guān)（r=0.54，p＜0.01）。3組C3、C4和CH5水平經(jīng)one-way ANOVA檢驗(yàn)，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均>0.05）。

    討論 
    天然免疫與獲得性免疫網(wǎng)咯關(guān)系是當(dāng)前免疫學(xué)的熱點(diǎn)研究之一。紅細(xì)胞已被證實(shí)是體內(nèi)數(shù)量最多的一種天然免疫細(xì)胞，參與T淋巴細(xì)胞、LAK細(xì)胞、NK細(xì)胞、吞噬細(xì)胞的免疫功能的調(diào)節(jié)，在機(jī)體免疫反應(yīng)和疾病發(fā)生發(fā)展中都具有十分重要的意義。CR1除分布于紅細(xì)胞外，還分布于粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、肥大細(xì)胞、綠泡樹(shù)突細(xì)胞、賢小球足突細(xì)胞、B細(xì)胞及部分CD T細(xì)胞等。血循環(huán)中85%的CR1都存在于紅細(xì)胞膜上，具有多種免疫作用，參與補(bǔ)體活化調(diào)節(jié)。

    CR1（CD35）是相對(duì)分子質(zhì)量為180000~260000的單鏈多態(tài)性跨膜糖蛋白，屬于補(bǔ)體激活調(diào)節(jié)因子家族成員，是血紅細(xì)胞免疫功能最重要的物質(zhì)基礎(chǔ)之一，其表達(dá)的高低直接影響循環(huán)免疫復(fù)合物（CIC）的清除。表達(dá)越多者活躍越高，清除CIC能力也越強(qiáng)表達(dá)越多者活性越高，清除CIC能力也越強(qiáng)，其表達(dá)形式由CR數(shù)量基因多態(tài)性（Hindl多態(tài)性）遺傳決定，也受后天多種因素影響。大量研究表明，大多數(shù)免疫相關(guān)疾病患者CR1分子與CIC的結(jié)合力及紅細(xì)胞膜上CR1分子是下降的，如腫瘤、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎已經(jīng)系統(tǒng)性紅斑狼瘡。提示紅細(xì)胞CR1的減少將引起免疫復(fù)合物儲(chǔ)存、運(yùn)輸障礙，可能是自身免疫性疾病發(fā)病和使病情加重原因之一。
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，健康對(duì)照組與人工劃痕癥組、慢性特發(fā)性蕁麻疹組外周血紅細(xì)胞CR1的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明慢性蕁麻疹患者血清中CR1表達(dá)較健康對(duì)照組高，此結(jié)果與白杰明等的研究相一致。提示CR1可能參與慢性蕁麻疹的發(fā)生，紅細(xì)胞CR1分子數(shù)量及其活性的增加，可能是慢性蕁麻疹患者紅細(xì)胞天然免疫功能存在亢進(jìn)和紊亂。

    在此基礎(chǔ)上我們觀察到，慢性蕁麻疹患者血清IgE與紅細(xì)胞CR1呈顯著正相關(guān)，且慢性蕁麻疹患者IgE<240µg/L組與>500µg/L組間CR1含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明當(dāng)CR1表達(dá)增高到一定程度時(shí)，IgE含量升高。當(dāng)致病原抗原進(jìn)入血液后，首選溶于血漿并被補(bǔ)體調(diào)理，被血紅細(xì)胞上為數(shù)眾多的補(bǔ)體受體CR1（CD35）所黏附，通過(guò)紅細(xì)胞上的CD58、CD59與淋巴細(xì)胞CD2共刺激分子相結(jié)合，進(jìn)而激活并促進(jìn)淋巴細(xì)胞等適應(yīng)性免疫細(xì)胞產(chǎn)生免疫效益應(yīng)。
CR1分子的數(shù)量既與先天基因表達(dá)有關(guān)，又受后天影響。先天性的因素主要為疾病本身基因多態(tài)性變化，后天性因素主要為自身免疫性疾病嚴(yán)重的程度，特別是CIC產(chǎn)生的速度、數(shù)量和持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)短。本研究結(jié)果表明，紅細(xì)胞CR1在慢性蕁麻疹患者中的表達(dá)存在異常，紅細(xì)胞表面的CR1與IgE之間的關(guān)系及病理過(guò)程中的調(diào)節(jié)機(jī)制值得進(jìn)一步深入研究。
（羅穎等,慢性蕁麻疹患者紅細(xì)胞補(bǔ)體受體1分子表達(dá)及外周血IGE和補(bǔ)體C3\C4水平的相關(guān)性研究[J]中安皮膚科雜志2012年12月第45卷第12期）

TAG：慢性蕁麻疹 蕁麻疹