高效毛細管電泳法研究鹽酸司來吉蘭膠囊的手性分離

    鹽酸司來吉蘭(Selegiline hydrochloride)為選擇性β型單胺氧化酶抑制劑，能抑制多巴胺受體突觸對多巴胺的再吸收，增加多巴胺的儲存，臨床上用于巴金森氏及其綜合癥，其分子結構見圖1，其中含有1個手性中心，有(D)，(L)2種光學異構體。大量藥效學研究結果表明其右旋異構體有藥效，而左旋異構體無效。英國藥典1998年版收載用HPLC法使鹽酸司來吉蘭手性分離，檢查左旋體的含量，控制藥品的質量。高效毛細管電泳法(HPCE)與高效液相色譜法(HPLC)相比較，柱效高，消耗低，成功應用于藥物手性分離已有報道，但用HPCE法對D-L鹽酸司來吉蘭進行手性分離的研究尚未見報道，本文通過加入HP-β-CD手性選擇劑使其光學異構體得到完全分離。

    1　儀器與試劑

    儀器：Beckman P/ACE 5500型全自動毛細管電泳儀配備二極管陣列檢測器和Gold軟件數據工作站。中性毛細管柱50 μm×56 cm(有效長度49 cm)。

    試藥：磷酸氫二鉀、磷酸、氫氧化鉀均為分析純；重蒸餾水；α-環糊精(α-CD)、β-環糊精(β-CD)、羥丙基-β-環糊精(HP-β-CD)(Sigma試劑)；D-L鹽酸司來吉蘭(光學純)，法國賽諾菲公司提供。鹽酸司來吉蘭片(批號6651197，6760298，6850689)賽諾菲民生制藥公司。

    對照品溶液的配制：稱取D-L鹽酸司來吉蘭約8 mg，用水溶解并稀釋至濃度為0.4 mg.L-1(1)和0.02 mg.L-1(2)。

    磷酸鹽緩沖液的配制：精密稱取磷酸氫二鉀17.4 g至100 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，濃度為100 mmol.L-1磷酸氫二鉀溶液，備用。

    2　實驗條件

    工作電壓：30 kV，檢測波長：200 nm，柱溫：15 ℃，陽極氣壓進樣3 s，每日毛細管依次用0.1 mol.L-1鹽酸溶液沖洗2 min，水沖洗2 min和運行緩沖液沖洗5 min，每次進樣前均用水和運行緩沖液各沖洗2 min。

    3　結果

    取D-L鹽酸司來吉蘭對照品溶液(2)在上述實驗條件下，以HP-β-CD濃度為20 mmol.L-1的50 mmol.L-1磷酸鹽緩沖液(pH 4.7)為運行液，進行電泳，記錄電泳圖；另稱取鹽酸司來吉蘭片細粉適量，用水溶解并過濾，濾液稀釋至濃度為2 mg.L-1的溶液，在上述實驗條件下電泳，記錄電泳圖，見圖2，按外標法以峰面積計算，結果3批鹽酸司來吉蘭片中L-鹽酸司來吉蘭含量均小于0.5%。

    4　討論

    4.1　手性選擇劑類型和濃度對對映體分離的影響
取α-CD、β-CD和HP-β-CD適量，分別制成濃度為20 mmol.L-1的50 mmol.L-1磷酸鹽緩沖液(pH 4.7)，用D-L鹽酸司來吉蘭對照品溶液(1)在上述實驗條件下分別以上述緩沖液為運行液，進行電泳，結果見圖3。以HP-β-CD為手性選擇劑，使D-L鹽酸司來吉蘭得到完全分離(D：14.7 min，L：15.2 min)；以β-CD為手性選擇劑，僅得到部分分離(D：9.3 min，L：9.4 min)；以α-CD為手性選擇劑，僅出單峰(D-L：9.7 min)，其對映體不能分離，說明在上述實驗條件下，HP-β-CD比α-CD和β-CD具有更好的手性識別能力，HP-β-CD的空腔與D-L鹽酸司來吉蘭相匹配，所以選擇HP-β-CD為D-L鹽酸司來吉蘭分離的手性選擇劑。
用HP-β-CD濃度分別為2，10，20，30，40，50 mmol.L-1的50 mmol.L-1磷酸鹽緩沖液(pH調至4.7)作為運行液，在上述實驗條件下，取D-L鹽酸司來吉蘭對照品溶液(1)進樣，當HP-β-CD的濃度為2 mmol.L-1時，其對映體不能分離，僅出單峰，當濃度為10 mmol.L-1時，僅部分分離，濃度為20～50 mmol.L-1均能達到基線分離，但濃度為50 mmol.L-1時，分離最佳。當HP-β-CD濃度增加時，D-L鹽酸司來吉蘭的遷移時間增加趨勢見圖4。當HP-β-CD濃度為20 mmol.L-1時，遷移時間較短，D-L鹽酸司來吉蘭對映體分離較好。

    4.2　運行液的酸度對對映體分離的影響　配制HP-β-CD濃度為20 mmol.L-1，滴加磷酸使pH分別為3.5，4.0，4.5，4.7，5.0，5.3的50 mmol.L-1磷酸鹽緩沖液作為運行液，用D-L鹽酸司來吉蘭對照品溶液(1)進樣，按上述實驗條件試驗，當運行液的pH值改變時，D-L鹽酸司來吉蘭峰的遷移時間情況見圖5。當pH為3.5時，呈單峰，當pH為4.0時，對映體僅部分分離，當pH為4.5～5.0時遷移時間呈平臺，pH為4.7時，遷移時間最短，對映體得到最佳分離，選擇為最佳運行液酸度。

    4.3　運行電壓和柱溫對D-L鹽酸司來吉蘭對映體分離的影響

    用20 mmol.L-1 HP-β-CD的50 mmol.L-1磷酸鹽緩沖液(pH為4.7)作運行液，當工作電壓從30 kV減少至10 kV時，電流從30 μA減少至10 μA，D-L鹽酸司來吉蘭峰遷移時間延長，峰也展寬，對映體分離度變差，選擇最佳工作電壓為30 kV。

    當柱溫從15 ℃增加至40 ℃時，運行電流從28 μA增加至48 μA，D-L鹽酸司來吉蘭峰遷移時間縮短，因焦耳熱背景噪音增加，對映體分離度差，所以選擇15 ℃為最佳柱溫。

    4.4　檢測波長對分析的影響　鹽酸司來吉蘭在215 nm處有最大吸收，在200 nm處有極大末端吸收，但運行緩沖液無吸收，當用200 nm作檢測波長時，峰響應值較215 nm處增加約1倍，使濃度為0.02 mg.mL-1的鹽酸司來吉蘭溶液的峰響應大于噪音的20倍左右，提高了最低定量限。故將鹽酸司來吉蘭的檢測波長定

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