臨床研究肉蔻五味(匝迪-5味)丸治療心肌梗死損傷的作用機(jī)制

    心肌細(xì)胞凋亡是近年國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，在許多心血管疾病如心肌梗塞、心臟猝死等的發(fā)生發(fā)展中，心肌細(xì)胞凋亡可能是重要的參與機(jī)制之一。近年研究認(rèn)為ISO可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生，但其機(jī)制不明。肉蔻五味丸是具有民族特色的傳統(tǒng)復(fù)方制劑，由廣棗、木香、土木香、篳茇、肉豆蔻組成。本實(shí)驗(yàn)采用大劑量ISO誘導(dǎo)的大鼠心肌梗死為模型，通過(guò)與卡托普利的對(duì)照研究，觀察肉蔻五味丸是否具有治療心肌梗死的作用，并從分子水平探討肉蔻五味丸治療心肌梗死損傷的作用機(jī)制。
   
1 　材料 
    1.1 動(dòng)物：雄性SD 大鼠66 只，體重（200±20）g ，由杭州省動(dòng)物中心提供。合格證號(hào)SCXK浙2003-0001。 
    1.2 藥品：鹽酸異丙基腎上腺素注射液（ISO）：上海禾風(fēng)制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：H31021344；卡托普利：安徽蕪湖市博英制藥有限公司，批號(hào)：H34023645；蒙藥肉蔻五味丸：內(nèi)蒙古烏蘭浩特市中蒙制藥有限公司，批號(hào)：Z15021785。 
    1.3 試劑：細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，編號(hào)：MK1020，武漢博士德公司產(chǎn)品。CoCl2•6H2O 試劑，上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品。 
    1.4 儀器：多導(dǎo)電生理記錄儀ML785 SP9612POWERLAB/ 8SPADI（澳大利亞）； 病理圖象分析系統(tǒng)OLYMPUS CX40LOGENE- I PAS9000；DU640 紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)（美國(guó)貝克曼公司）。

 
2 　方法 
    2.1 動(dòng)物分組：將66 只雄性SD大鼠隨機(jī)分為6 組，正常組6只，模型組12 只，卡托普利治療組12只，肉蔻五味丸低劑量治療組12只，肉蔻五味丸中劑量治療組12只，肉蔻五味丸高劑量治療組12 只。 

 
    2.2 模型制備及取材：模型組和治療組大鼠皮下注射IS010mg/kg，連續(xù)3 天。并以注射IS0 第3 天后心電圖的改變來(lái)判斷模型成立�？ㄍ衅绽�組和肉蔻五味丸組在注射IS0 第3 次后12 小時(shí)開(kāi)始分別給予卡托普利50mg/ kg ，低劑量肉蔻五味丸0.2g/ kg ，中劑量肉蔻五味丸0.5g/ kg ，高劑量肉蔻五味丸1g/ kg 灌胃，模型組與正常組則灌胃等體積的生理鹽水，1天1次，至各實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)。各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在開(kāi)始灌胃后3d、7d相應(yīng)時(shí)段用3 % 戊巴比妥鈉50mg/ kg 腹腔麻醉后分別處死6只，正常對(duì)照組于第7 天全部處死。心臟取血做IMA，心臟標(biāo)本用4 %甲醛固定24h，做4μm 厚的石蠟連續(xù)切片，分別做HE 和TUNEL 染色。 
 
    2.3 IMA 檢測(cè)：根據(jù)Bar-Or等建立的比色測(cè)定法測(cè)定。將50μl 0.1 % CoCl2•6H2O 水溶液中加入200μl 待測(cè)血清，輕輕混勻，放置10min，再加入50μl15 %二巰基蘇糖醇（DTT）水溶液，使其顯色2min，最后加入0.9 % NaCl 溶液10ml 終止反應(yīng)，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定其在470nm 處的吸光度ABSU；同時(shí)，每一測(cè)試樣本均要求做樣本空白（加DTT 改為加蒸餾水），結(jié)果用吸光度單位報(bào)告（ABSU）。

    
    2.4 原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)：采用TUNEL法，具體步驟按試劑盒說(shuō)明操作，陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞核被染成棕褐色為陽(yáng)性結(jié)果。

   
    2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS1310 軟件分析，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X ±S）表示，兩組間比較用t 檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析。

  
3 　結(jié)果 
    3.1 　心肌梗死大鼠心臟的病理變化 
    肉眼觀：心肌梗死區(qū)形狀不規(guī)則，梗死灶呈蒼白色，第7 天在梗死灶周邊出現(xiàn)明顯的充血、出血帶。光鏡下可見(jiàn)心肌細(xì)胞漿嗜伊紅性增高，心肌纖維不均勻性肥大，胞核增多，增大深染，梗死灶邊緣可見(jiàn)充血帶及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，正常組大鼠未見(jiàn)異常改變。

  
    3.2 　IMA 檢測(cè)
用比色法測(cè)定血清中白蛋白與外源性鈷結(jié)合能力的變化，結(jié)果用吸光度單位報(bào)告（ABSU），見(jiàn)表1。

    各組大鼠造模后IMA 情況提示：ISO 造成心肌缺血損傷可明顯引起IMA 降低，尤以早期顯著，肉蔻五味丸中、高劑量治療組及卡托組可顯著提高IMA 水平，與模型組比較差異有顯著性（ P< 0.01），與卡托普利治療組比較，肉蔻五味丸高劑量治療組無(wú)明顯差異（P >0.05）。 
   
    3.3 　心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果TUNEL 法檢測(cè)各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡的情況以細(xì)胞核被染成棕褐色為陽(yáng)性表達(dá)，陰性對(duì)照片（PBS為一抗）無(wú)棕黃色著色。每張切片在光鏡下隨機(jī)選取10 個(gè)視野，計(jì)算在1 000個(gè)細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。結(jié)果見(jiàn)表2。

    各組大鼠造模后心肌細(xì)胞凋亡情況提示：連續(xù)注射異丙基腎上腺素造成大鼠心肌缺血損傷，可明顯引起心肌細(xì)胞凋亡，尤以早期顯著，肉蔻五味丸治療組及卡托組心肌細(xì)胞凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少，與模型組比較，差異有顯著性（P < 0.05），其中尤以肉蔻五味丸高劑量組更為顯著。

  
4 討論 
    大劑量異丙基腎上腺素（i soprenaline，ISO）所造成的大鼠心肌梗死模型，其心電圖演變、心肌代謝改變及組織病理學(xué)的變化均與人類(lèi)自然發(fā)生的急性心肌梗死非常接近；本實(shí)驗(yàn)中心電圖顯示異常Q 波，ST 段抬高超過(guò)0.05mv，與臨床心肌梗死的心電變化相似，提示模型成功建立。

  
    心肌梗死會(huì)導(dǎo)致白蛋白的N末端結(jié)構(gòu)發(fā)生一些改變，正是這種結(jié)構(gòu)的改變影響了白蛋白與外源性鈷元素的結(jié)合能力。因此通過(guò)檢測(cè)血漿中白蛋白與鈷元素的結(jié)合能力，就可以了解因梗死而改變的白蛋白的水平。心肌缺血血清白蛋白與鈷離子的結(jié)合和非梗死相比結(jié)合力下降，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示治療組與模型組相比（ P< 0.05）有顯著意義。 

 
    目前雖然對(duì)心肌梗死損傷的確切機(jī)制還不十分清楚，但已證實(shí)，持續(xù)性心肌缺血可以導(dǎo)致組織損傷和細(xì)胞死亡，過(guò)去認(rèn)為心肌細(xì)胞在梗死損傷中死亡全部是壞死，但近年來(lái)大量的研究表明大鼠及人的心肌梗死損傷中有大量的心肌細(xì)胞經(jīng)歷了調(diào)亡過(guò)程〔2～5〕。本實(shí)驗(yàn)中給藥組動(dòng)物心肌梗死邊緣區(qū)凋亡現(xiàn)象的觀察顯示藥物治療組的凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較模型組明顯減少，給藥3 天與7 天時(shí)相比，隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡有所減少，與模型組比較，卡托治療組與肉蔻五味丸高劑量治療組的細(xì)胞凋亡陽(yáng)性數(shù)顯著降低（P < 0.01）。本實(shí)驗(yàn)提示通過(guò)抑制和阻斷細(xì)胞凋亡的發(fā)生，可能是蒙藥肉蔻五味丸防治冠心病心肌梗死損傷的作用機(jī)制之一。

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