許　波,楊　軍　　(第三軍醫大學附屬西南醫院口腔科,重慶400038)

 

　　三叉神經損傷臨床較為常見,本研究通過建立動物模型,探討外源性NGF 對三叉神經下頜支損傷后感覺神經元細胞凋亡及凋亡相關因子Bcl22 及Bax 的影響,以期尋求一種更為理想的周圍神經缺損的修復方法提供理論依據。

 

1. 1 　動物分組及模型建立

　　健康雄性成年Wistar 大鼠120 只,體重250～300 g(第三軍醫大學實驗動物中心提供) 。分為三大組,每組6 只,正常對照組, 左側三叉神經下頜支離斷后單純吻合組,左側三叉神經下頜支離斷后吻合+ NGF 組(NGF組) 。

　　大鼠經1 %戊巴比妥鈉(50～60 mg/ kg) 腹腔注射麻醉后,備皮、消毒,切開左側下頜下緣皮膚、肌肉,骨膜,掀起頰側軟組織瓣,顯露下頜骨,找出下齒槽神經血管束。去除下頜骨下1/ 3頰側骨板,顯露下齒槽神經血管。在手術顯微鏡下,仔細分離下齒槽神經。自頦孔向后約6 mm 處切去下齒槽神經6 mm ,任其回縮。神經離斷后0、3、7 d 用14 mm長的硅膠管(內徑115mm ,外徑210 mm) 橋接,9 個0 無損傷尼龍線穿過神經斷端外膜,兩端分別套入管內2 mm并固定于管壁上,對左側下齒槽神經造成10 mm缺損。同時管內注射NGF(中國軍事醫學科學院

基礎醫學研究所提供) 溶液(1 mg/ L) 30μl 或等量的生理鹽水。術后分別飼養15 d ,30 d。各組動物飼養至所需時間后用4 %的多聚甲醛灌注取材。

1. 2 　取材、固定、初步處理及切片

　　方法參照文獻[1 ] ,取材于三叉N 感覺核區,沿大腦腳蓋中部靠外側(前囟后9168 mm ,中線旁0168 mm) ,行冰凍冠狀連續切片(10μm) ,切片置于- 20 ℃冰箱中保存以備用。

1. 3 　觀察方法

1. 3. 1 　原位末端標記法(Terminal deoxycleotidy12transferase2medi2ated dUTP2biotin nick end labeling TUNEL) 標記凋亡細胞　　

TUNEL 法試劑盒購至博士德公司(MK 1 020) ,操作參照說明書進行,在×100 普通光鏡下觀察感覺核區內TUNEL 陽性細胞形態。

1. 3. 2 　免疫細胞化學法檢測凋亡相關因子Bcl22 及Bax 　　免疫細胞化學法檢測試劑盒購至博士德公司(MK 1 102) ,操作參照說明書進行,在×100 倍普通光鏡下觀察感覺核區內Bcl22、Bax 表達。

1. 3. 3 　圖像分析及統計學分析　　取各實驗組不同時相點感覺核區內陽性細胞數量進行統計,比較各組TUNEL 陽性細胞數量以及Bcl22、Bax 表達量的差異。數據采用方差分析。

 

2. 1 　NGF 對凋亡細胞數量的影響

　　凋亡的神經元細胞經TUNEL 法染色胞核呈黃褐色,從而可以在顯微鏡下觀察到著色的凋亡細胞。細胞核中有棕黃色顆粒,胞質不著色者為陽性細胞(凋亡細胞) 。軟件圖像灰度比分析結果顯示,與正常對照組相比,單純吻合組與NGF 組的神經元凋亡數都明顯增加,但0 d、3 d 吻合的NGF 組凋亡數明顯少于單純吻合組( P < 0101) ,而7 d 吻合NGF 組細胞凋亡數與單純吻合組無明顯差異( P > 0105) 。

2. 2 　NGF 對Bcl22 及Bax 的影響

　　免疫細胞化學顯示,Bcl22 及Bax 在正常成年大鼠三叉神經感覺神經元中表達很低,僅見少量免疫反應可疑陽性細胞,細胞著色很淡。與正常對照組相比,單純吻合組與NGF 組的神經元細胞Bcl22 及Bax 的表達不同程度地增高,NGF 組中Bcl22的表達明顯高于單純吻合組( P < 0101) 而單純吻合組中Bax 的表達明顯高于NGF 組( P < 0101) 。

 

　　在中樞神經系統發育過程中,神經損傷所導致的神經元變性和壞死可引起軸突再生的失敗,這可能與損傷引起的神經元凋亡有關。研究發現神經生長因子(NGF) 與神經細胞凋亡的關系十分密切[2 ] ,其生物學作用不僅表現在可阻止神經元發育過程中凋亡的發生,同時對調節神經元的連接也有重要的作用。但是關于NGF 對三叉神經損傷后感覺神經元細胞的凋亡是否具有抑制作用目前尚未見報道。

　　本研究發現NGF 可以抑制損傷后三叉神經感覺核神經元細胞的凋亡,結果同時顯示,7 d 吻合加NGF 組與單純吻合組的神經元凋亡數無明顯差異,提示神經損傷后盡快恢復神經的連續性及軸漿運輸通道是十分必要的。

　　人們在凋亡的分子生物學研究中還發現,凋亡與胞核內某些基因有關,Bcl22 家族是研究較早的與凋亡有關的基因。B 細胞淋巴瘤/ 白血病22 (B2cell lymphoma/ leukemia22 , Bcl22) 中有的稱為抑凋亡基因,如Bcl22 ;有的則稱為促凋亡基因,如Bax。這些基因家族成員自身或彼此之間形成二聚體/ 多聚體。Bcl22家族的蛋白2蛋白相互作用調節著細胞的存活與凋亡,核心是Bcl22 與Bax 的相互作用[3 ] 。有實驗表明[4 ] ,在節狀神經元中Bcl22 的抗凋亡效應完全依賴Bax 的存在;而在三叉神經元中Bcl22 的抗凋亡效應并不依賴Bax 的存在,從而說明Bcl22 的抗凋亡效應或是通過抑制其他促凋亡蛋白來發揮或是由Bcl22 直接抑制死亡效應蛋白所致。本實驗結果表明三叉神經損傷后,局部給予外源性NGF 可使抗凋亡基因Bcl22 和促凋亡基因Bax均增加,但Bcl22 更加顯著,這樣Bcl22 與Bax 的相對比例增加,從而抑制凋亡,這與有的學者研究結果一致。

　　綜上所述,本實驗結果顯示,三叉神經下頜支損傷后,在盡早恢復神經的連續性的同時局部早期予以外源性NGF ,可更加明顯地減少神經元的凋亡,有效地促進神經元的結構和功能的恢復。但目前關于NGF 調節神經細胞凋亡機制尚未完全闡明,還有許多未知調控因素以及相關基因對細胞凋亡的調控機制有待于進一步深入研究。

 

 

參考文獻:

[1 ] 蔡文琴,王伯氵云主編. 實用免疫細胞化學與核酸分子雜交技術[M] . 成都:四川科學技術出版社,1992. 128.

[ 2 ] Derby A , Engleman V W, Frierdich G E , et al . Nerve growth factor facili2tates regeneration across nerve gaps : morphological and behavioral studies inrat sciatic nerve[J ] . Exp Neurol ,1993 ,119 (11) :176 - 191.

[3 ] Merry E , Korsmeyer SJ . Bcl22 gene family in the nervous system[J ] . An2nu Rev Neurosci ,1997 ,20 (3) :245 - 257.

[4 ] LindenboimL , Yuan J , Stein R. Bcl2xS and Bax induce different apoptoticpathways in PC12 cells[J ] . Oncogene ,2000 ,19(14) :1 783 - 1 793.

(編輯　陳聰連)