氧化苦參堿(苦參素)膠囊治療慢性病毒性肝炎肝纖維化的隨機(jī)、雙盲、安慰劑對(duì)照的多中心臨床研究

　　肝纖維化是肝臟對(duì)各種原因所致肝損傷的代償修復(fù)反應(yīng)，表現(xiàn)為肝內(nèi)纖維結(jié)締組織增生與沉積，是多種慢性肝病共有的病理過(guò)程。阻斷肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展具有重要的意義。氧化苦參堿是從中藥苦豆子中提取的一種生物堿，在動(dòng)物體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中已證實(shí)具有抗肝纖維化的作用。本文報(bào)道苦參素膠囊治療慢性病毒性肝炎肝纖維化的臨床研究結(jié)果。

研 究 方 法

一、 研究設(shè)計(jì)

　　本研究為多中心、隨機(jī)、雙盲、安慰劑平行對(duì)照的臨床試驗(yàn)。入選病例隨機(jī)進(jìn)入苦參素膠囊組（A組）或空白安慰劑對(duì)照組（B組），兩組各為72例，療程52周。本研究遵循我國(guó)頒布的新藥臨床試驗(yàn)管理規(guī)范（GCP）進(jìn)行，方案經(jīng)上海市消化疾病研究所國(guó)家藥品臨床研究基地倫理委員會(huì)討論通過(guò)，每個(gè)病人均簽署知情同意書(shū)。

二、 病人

　　入選標(biāo)準(zhǔn)為：1、年齡：18--65歲，性別不限；2、篩選前血清HBV和/或HCV標(biāo)志物陽(yáng)性并至少6個(gè)月；3、篩選前近6個(gè)月內(nèi)曾有兩次或兩次以上血清ALT異常； 4、入選前一個(gè)月內(nèi)肝組織學(xué)檢查按1995年全國(guó)慢性病毒性肝炎分級(jí)分期的標(biāo)準(zhǔn)肝纖維化分期為1～4期，且肝纖維化半定量計(jì)分系統(tǒng)（SSS）計(jì)分≥1分；5、血清總膽紅素≦85.5μmol/l；6、治療前6月內(nèi)未用過(guò)抗病毒藥、免疫調(diào)節(jié)劑及其他治療肝纖維化藥物；7、研究中同意不服用全身抗病毒藥、細(xì)胞毒藥、激素、免疫調(diào)節(jié)劑、降酶退黃藥物和中藥等。需排除以下情況：已知血清HIV陽(yáng)性；失代償期肝病；有自身免疫性肝炎征象者（抗核抗體滴度 >1:160）；骨髓抑制；血清肌酐>正常上限1.5倍；合并影響本療法的有關(guān)疾病者[如：不穩(wěn)定性糖尿病、腎功能不全、不穩(wěn)定性心絞痛、酒精性肝病、癲癇、臨床有明顯的神經(jīng)病變、吸毒、精神病、胰腺炎、吸收不良及惡性疾病等]；首劑前30天接受其它研究藥者；對(duì)苦參素過(guò)敏者；妊娠及哺乳期；有受孕可能而未采取有效避孕措施者。

三、 治療方法及藥物

　　在篩選評(píng)價(jià)完成后，合格的病人隨機(jī)分配到A組或B組。A組：52周口服苦參素膠囊（300mg tid po）+ 維生素C片 2粒tid po 和 復(fù)合維生素B片 2粒 tid po；B組：52周口服空白膠囊3片tid po + 維生素C片 2粒tid po 和 復(fù)合維生素B片 2粒 tid po。療程為52周，病人每隔12周隨訪一次，所有病人于停藥后12周門(mén)診隨訪。苦參素膠囊為寧夏藥物研究所和上海綠谷偉業(yè)生態(tài)工程有限公司的產(chǎn)品，空白膠囊、維生素C片和 復(fù)合維生素B片均由寧夏藥物研究所和上海綠谷偉業(yè)生態(tài)工程有限公司提供。

四、 觀察項(xiàng)目及考核

1、 臨床表現(xiàn) 臨床癥狀和體征按癥狀分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分為0-3級(jí)，每次隨訪時(shí)評(píng)估，治療24周、52周及停藥后12周進(jìn)行考核。
2、 血、尿常規(guī)和相關(guān)肝功能檢查 每次隨訪時(shí)評(píng)估，治療52周及停藥后12周進(jìn)行考核。
3、 肝纖維化血清標(biāo)志物檢測(cè)：包括：透明質(zhì)酸（HA）、層粘素（LN）、III型前膠原肽（PIIIP）、IV型膠原-7S（IV-7S）。肝纖維化血清標(biāo)志物檢測(cè)統(tǒng)一由第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)征醫(yī)院全軍臨床免疫研究中心完成。治療前、治療24周、52周及停藥后12周時(shí)評(píng)估，治療24周、52周及停藥后12周進(jìn)行考核。
4、 影像學(xué)B超檢查：包括肝右葉最大斜徑、門(mén)靜脈主干內(nèi)徑及每分鐘血流量參數(shù)、脾臟的脾門(mén)處厚度及脾靜脈內(nèi)徑五項(xiàng)指標(biāo)。定機(jī)、定人操作，電腦存盤(pán)后由專(zhuān)家組統(tǒng)一讀片。治療前、治療52周時(shí)評(píng)估，治療52周進(jìn)行考核。
5、 病理學(xué)檢查：組織學(xué)標(biāo)本由復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理教研室的三位病理學(xué)家按肝纖維化半定量計(jì)分系統(tǒng)（SSS）1進(jìn)行獨(dú)立讀片，讀片結(jié)果由三位非參與本課題的病理學(xué)家經(jīng)Kappa檢驗(yàn)證明，三位專(zhuān)家讀片的一致性良好。所有病人治療前、部分病人治療52周時(shí)評(píng)估，治療52周進(jìn)行考核。
6、 治療期間及治療結(jié)束時(shí)需記錄合并用藥、詢(xún)問(wèn)不良反應(yīng)并對(duì)病人依從性進(jìn)行檢查。

五、 療效評(píng)價(jià)

（ 一）、病理組織學(xué)指標(biāo)的療效評(píng)價(jià)

　　本臨床試驗(yàn)病理組織學(xué)療效考核采用肝纖維化半定量計(jì)分（SSS）系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)判。判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：
顯效：
　　肝組織活檢肝纖維化分期SSS評(píng)分較治療前下降≥6分
有效：
　　肝組織活檢肝纖維化分期SSS評(píng)分較治療前下降≥2分
無(wú)效：
　　凡未達(dá)到有效標(biāo)準(zhǔn)者為無(wú)效

（二）、非創(chuàng)傷性指標(biāo)的療效評(píng)價(jià)

　　按臨床、血清肝纖維化標(biāo)志物及影像學(xué)B超指標(biāo)綜合判斷，標(biāo)準(zhǔn)如下：
顯效：
1、治療后血清肝纖維化指標(biāo)（P-III-P、IV-7S、HA、LN等）有任何兩項(xiàng)測(cè)定值較治療前下降≥80%；
2、治療后B超五項(xiàng)指標(biāo)中至少門(mén)靜脈主干內(nèi)徑和脾厚度恢復(fù)正常
3、癥狀體征消失或總分下降≥75%
有效：
1、治療后血清肝纖維化指標(biāo)（P-III-P、IV-7S、HA、LN等）有任何兩項(xiàng)測(cè)定值
較治療前下降≥40%；
2、治療后B超五項(xiàng)指標(biāo)中至少門(mén)靜脈主干內(nèi)徑或脾厚度縮小
3、癥狀體征基本消失或總分下降≥25%
無(wú)效：
凡未達(dá)到有效標(biāo)準(zhǔn)者為無(wú)效

六、 安全性評(píng)價(jià)

　　記錄治療期間臨床和實(shí)驗(yàn)室檢查發(fā)生的任何不良事件，按WHO和我國(guó)衛(wèi)生部1994年公布的不良反應(yīng)判斷標(biāo)準(zhǔn)分為4級(jí)。

七、 統(tǒng)計(jì)處理

　　由上海第二醫(yī)科大學(xué)生物統(tǒng)計(jì)教研室蘇炳華教授和何清波教授承擔(dān)。采用SAS6.12軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.

研 究 結(jié) 果

一、入選病人

　　共144例病人入組。治療中脫落、剔除12例。故有132例病人按方案要求完成治療，其中膠囊組66例，對(duì)照組66例。各組治療前在性別、年齡、是否飲酒、肝炎病程、肝功能異常時(shí)間及ALT、AST超過(guò)正常2倍等基本情況均相似（P值分別>0.05）。所有入組病例治療前均作肝活檢。二次肝活檢共49例，其中A組25例，B組24例。

二、觀察指標(biāo)分析

（一）、臨床癥狀和體征

　　治療52周后，A組除鼻衄癥狀（P=1.0000）外，其余癥狀均顯著改善（P值分別<0.05），肝腫大（P=0.0313）體征治療后顯著改善；B組的齒齦出血及鼻衄無(wú)顯著改善（P值分別>0.05），肝腫大、脾腫大和肝掌體征治療后有顯著差異（P值分別<0.05）；組間比較納差（P=0.0263）癥狀改善A組優(yōu)于B組。

（二）肝功能情況

　　治療52周后，A組除GGT、SB外（P值分別>0.05），其余指標(biāo)均顯著改善（P值分別<0.05）；B組ALT、AST、SB、SB，及ALP無(wú)顯著改善（P值分別>0.05）；組間比較，A組的ALT（P=0.0007）和AST（P=0.0025）改善較B組更顯著。治療52周后，A組ALT復(fù)常率為70.77%顯著高于B組39.68%（P=0.0003）。A組46例治療52周后ALT正常的病人中有14例于停藥12周后異常，占30.43%；B組25例治療52周后ALT正常的病人中有12例于停藥12周后異常，占48.00%。

（三）肝組織學(xué)檢查

1、 SSS計(jì)分值肝纖維化的治療前后評(píng)估
　　治療后A組肝纖維化SSS計(jì)分由治療前的6.76±6.67降為治療后的4.72±5.63，有非常顯著改善（P =0.0001），B組則顯著惡化（P =0.0009）；兩組間比較有顯著差異，P值為0.0000。見(jiàn)表1

　　　　　　　　　　　　　　表1 肝纖維化SSS計(jì)分值治療前后的情況及比較

組別 治療前 治療后 治療前后差值 治療前兩組比較 治療前后組內(nèi)比較 前后差值兩組比較
統(tǒng)計(jì)量 P值 統(tǒng)計(jì)量 P值 統(tǒng)計(jì)量 P值
A組 6.76±6.67(25) 4.72±5.63(25) 2.04±2.59(25) 1.4098 0.1586 96.0 0.0001 4.8834 0.0000
B組 4.13±2.83(24) 6.33±4.04(24) -2.21±3.72(24) 83.0 0.0009

2、 SSS計(jì)分值肝臟炎癥的治療前后評(píng)估
　　治療后A組肝炎癥SSS計(jì)分由治療前的6.08±3.84降為治療后的4.00±2.97，有非常顯著改善（P=0.0002），B組則無(wú)顯著改善（P =0.2344）；兩組間比較有顯著差異，P值為0.0008。見(jiàn)表2

　　　　　　　　　　　　　　表2 肝炎癥SSS計(jì)分值治療前后的情況及比較

組別 治療前 治療后 治療前后差值 治療前兩組比較 治療前后組內(nèi)比較 前后差值兩組比較
統(tǒng)計(jì)量 P值 統(tǒng)計(jì)量 P值 統(tǒng)計(jì)量 P值
A組 6.08±3.84(25) 4.00±2.97(25) 2.08±2.71(25) 0.0407 0.9675 69.5 0.0002 3.3543 0.0008
B組 6.08±4.06(24) 6.92±4.17(24) -0.83±3.38(24) 21.5 0.2344

（四）、血清肝纖維化標(biāo)志物檢查

　　治療24周后及52周后，A組HA、LN、PIIIP和IV-7S均顯著改善（P值分別<0.05），B組LN、PIIIP及IV-7S顯著改善（P值分別<0.05）；HA、PIIIP改善兩組間比較有顯著差異（P值分別<0.05）。
停藥12周后，A組四項(xiàng)指標(biāo)中，除LN外（P =0.1493），其余指標(biāo)與治療52周后比均有顯著升高（P值分別<0.05）；B組除HA外（P =0.4214），其余指標(biāo)與治療52周后比均有顯著升高（P值分別<0.05）；兩組間比較HA（P =0.0002）A組升高比B組更明顯、IV-7S（P =0.0048）B組升高比A組更明顯。

（五）、影象學(xué)檢查

　　治療后A組門(mén)靜脈主干直徑顯著變窄、脾厚顯著減小（P值分別<0.05），B組門(mén)靜脈主干直徑顯著更寬、門(mén)靜脈每分鐘血流量參數(shù)顯著增大、脾厚度顯著增大、脾靜脈直徑顯著更寬（P值分別<0.05）；門(mén)靜脈主干直徑和脾厚度指標(biāo)變化兩組間比較有顯著差異（P值分別<0.05）。

三、療效分析

（一）、SSS評(píng)分系統(tǒng)的病理組織學(xué)療效判斷
　　治療后A組顯效率和有效率均為24%，總有效率為48%；B組無(wú)人達(dá)顯效，有效率為4.17%；兩組無(wú)論從顯效率和總有效率比較均有非常顯著差異，后者p值為0.0004。見(jiàn)表3。

　　　　　　　　　　　　　　　　表3 肝纖維化病理組織學(xué)療效

組別 顯效 有效 無(wú)效 兩組療效的比較
統(tǒng)計(jì)量 P值
A組（N=25） 6(24.00%) 6(24.00%) 13(52.00%) 12.6970 0.0004
B組（N=24） 0(0.00%) 1(4.17%) 23(95.83%)

（二）、肝纖維化血清標(biāo)志物的療效判斷

　　治療24周后，A組總有效率57.43%顯著高于B組24.24%（P =0.0002）。治療52周后，A組總有效率為68.19%顯著高于B組34.85%（P =0.0004）。停藥12周后，A組總有效率為50.00%顯著高于B組15.16%（P =0.0000）。

（三）肝纖維化非創(chuàng)傷性指標(biāo)的療效評(píng)判

　　A組顯效率和有效率分別為3.03%和63.64%，總有效率為66.67%；B組顯效率和有效率分別為0%和30.30%，總有效率為30.30%；兩組比較有非常顯著差異（P =0.0001）。見(jiàn)表4。

表4 肝纖維化非創(chuàng)傷性指標(biāo)的療效

組別 顯效 有效 無(wú)效 兩組療效的比較
統(tǒng)計(jì)量 P值
A組（N=66） 2(3.03%) 42(63.64%)  22(33.33%)  16.2494 0.0001
B組（N=66）  0(0.00%) 20(30.30%)  46(69.70%) 

四、不良反應(yīng)

　　本研究過(guò)程中A組有5例病人發(fā)生不良反應(yīng)，不良反應(yīng)發(fā)生率為6.94%；不良反應(yīng)主要表現(xiàn)為惡心、皮疹、胸悶、發(fā)熱、上腹不適、腹瀉和口苦，大多為輕、中度，沒(méi)有病例因不良反應(yīng)而退出治療。B組有7例發(fā)生不良反應(yīng)，不良反應(yīng)發(fā)生率為9.72%，不良反應(yīng)具體表現(xiàn)與膠囊組類(lèi)同，有一例病人因服藥后乏力、食欲減退、胃部不適中止治療而脫落。

討 論

　　氧化苦參堿是從中藥苦豆子中提取的一種生物堿，具有抗炎、抗病毒、抑制免疫、抗腫瘤等多種生物學(xué)作用2。藥代及藥效學(xué)研究表明3，用氧化苦參堿給大鼠灌胃后，在胃腸道轉(zhuǎn)化為較易被腸道吸收的苦參堿，藥物在組織中的分布以苦參堿為主，主要集中在腎、脾、肝，排泄以腎臟為主；氧化苦參堿吸收后，分布范圍小，半衰期較短，消除快，血藥濃度相對(duì)較高，這是因?yàn)檠醯慕Y(jié)構(gòu)改變了藥物的極性，而影響其藥代動(dòng)力學(xué)；其藥代及藥效學(xué)均為非劑量依賴(lài)性。因此，在口服氧化苦參堿后，血液和靶細(xì)胞中有足夠的濃度發(fā)揮其藥理作用。

　　肝纖維化是慢性肝病重要的病理特征，也是進(jìn)一步向肝硬化發(fā)展的中間環(huán)節(jié)。其發(fā)生的主要機(jī)制是細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的過(guò)度增多和異常沉積。目前認(rèn)為肝星狀細(xì)胞（HSC）激活并轉(zhuǎn)化為肌成纖維樣細(xì)胞和成纖維細(xì)胞是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的核心環(huán)節(jié)。在氧化苦參堿防治半乳糖胺誘導(dǎo)大鼠肝纖維化的研究中發(fā)現(xiàn)，氧化苦參堿可有效地抑制HSC活化，降低TGFb1分泌，從而抑制膠原合成，表現(xiàn)在肝組織學(xué)上治療組匯管區(qū)及狄氏間隙I、III型膠原明顯減少4。本研究也提示氧化苦參堿膠囊治療后能顯著地改善病理組織學(xué)SSS計(jì)分系統(tǒng)肝纖維化程度及肝臟炎癥程度，治療后肝纖維化SSS計(jì)分由治療前的6.76±6.67降為治療后的4.72±5.63，而對(duì)照組則顯著惡化；肝炎癥SSS計(jì)分由治療前的6.08±3.84降為治療后的4.00±2.97。在四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化模型用氧化苦參堿治療后，血清ALT、HA、IV型膠原、肝組織內(nèi)炎癥活動(dòng)度及纖維組織增生程度均明顯減輕5。本研究也證實(shí)口服氧化苦參堿后HA、LN、PIIIP及IV-7S均顯著降低。

　　目前認(rèn)為，肝纖維化治療和抗肝纖維化是兩個(gè)不同的概念，抗肝纖維化藥物應(yīng)作用于肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的各環(huán)節(jié)。氧化苦參堿可能通過(guò)多種途徑達(dá)到抗肝纖維化作用。首先，在病因治療上，氧化苦參堿能有效地治療慢性病毒性肝炎，促使慢性乙型及丙型病毒性肝炎病毒標(biāo)志陰轉(zhuǎn)，降低丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）6-7。其次，體外細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，氧化苦參堿濃度在0.5-16mg時(shí)對(duì)HSC增殖有抑制作用8。此外，氧應(yīng)激及脂質(zhì)過(guò)氧化是引起肝細(xì)胞損傷及HSC活化的重要機(jī)制，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化是抗肝纖維化的重要環(huán)節(jié)，楊文卓等報(bào)道氧化苦參堿具有減輕脂質(zhì)過(guò)氧化作用，其保護(hù)肝細(xì)胞、抑制HSC合成和分泌ECM及TGFb1等促纖維形成因子的作用，可能是抗脂質(zhì)過(guò)氧化的結(jié)果9。其他的基礎(chǔ)研究顯示氧化苦參堿可阻斷小鼠肝細(xì)胞的凋亡10、抑制膠原合成、抑制肝內(nèi)纖維組織增生、抑制肝組織內(nèi)炎癥活動(dòng)度、下調(diào)TNF-a水平11，并且具有抑制成纖維細(xì)胞增殖及III型原膠原mRNA的表達(dá)12。本研究無(wú)論從病理組織學(xué)改善，還是從臨床癥狀、血清肝纖維化標(biāo)志物、相關(guān)肝功能、影象學(xué)等非創(chuàng)傷性指標(biāo)的改善，均提示氧化苦參堿膠囊是一個(gè)較理想的治療肝纖維化藥物。應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)基礎(chǔ)和臨床研究探討氧化苦參堿抗肝纖維化的確切機(jī)制。

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