葡萄籽原花青素降低動脈粥樣硬化兔內皮粘附分子水平

　　葡萄籽原花青素（grape seed proanthocyanidin extract，GSPE）是從葡萄籽中提取的多酚類混合物，其原花青素含量超過95%。原花青素具有多種生物學活性，最新研究發現它具有抗動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）等作用 ［1］ 。為深入研究GSPE抗AS的作用機制，開發GSPE，以應用于防治AS新領域，筆者采用含1%的膽固醇顆粒飼料建立新西蘭大白兔AS模型，在建立模淹的同時用含1%的GSPE顆粒飼料進行預防干預實驗，首次觀察了GSPE對兔血清細 ˇ 胞間粘附分子（intercellular adhesion molecule，ICAM-1）、血管細胞粘附分子（vascular cell adhesion molecule，VCAM-1）和E-選擇素的影響。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 藥品與試劑 GSPE，購于天津尖峰天然產物研究開發有限公司，批號20020525，原花青素含量96.08%。該GSPE質量標準為:外觀呈紅棕色粉末狀，味道澀，多酚≥95%（GAE檢測），在酸中溶解，水中不溶物≤5.0%（1%25℃檢測），醇中不溶物≤5.0%（1%25℃檢測），粒徑100目，灰分≤0.5%（CHP2000檢測），干燥失重≤5.0%（CHP2000檢測），堆積密度0.25～0.35g/ml，拍后密度0.40～0.50g/ml，pH（4%溶于水）為2.5～4.5（CHP2000檢測），重金屬≤10ppm（CHP2000檢測），鐵鹽≤10ppm（CHP2000檢測），砷鹽≤2ppm（CHP2000檢測）。膽固醇，購于上海新興化工試劑研究所，批號020628。兔ICAM-1、VCAM-1和E-選擇素ELISA試劑盒均購于美國TPI Inc，批號分別為0813B1、0816B1、0817B2，靈敏度均為ng/ml。

　　1.1.2 實驗動物 雄性新西蘭大白兔30只，購自山東齊魯制藥廠（合格證號:魯動質字D20020613號），6月齡，平均體重2.65±0.23kg。

　　1.1.3 飼料制備 根據動物日常食量，按每只每天120g飼料，實驗時間為12周計算各組飼料總量，并根據組別計算各組飼料中膽固醇、GSPE的添加量，分別制備各組飼料。取所需添加量的膽固醇，用標準飼料倍比稀釋，攪拌均勻，直至膽固醇在料中占1%，制粒，干燥，即得標準+1%膽固醇的顆粒飼料。同法制備標準+1%膽固醇+1%GSPE顆粒飼料備用。

　　1.2 方法

　　1.2.1 研究設計 實驗采用重復測量的成組設計。上述 新西蘭大白兔均在實驗條件下分籠喂養，自由飲水，適應喂 養1周后，隨機分為3組，正常對照（A）組、高脂模型（B）組、GSPE預防干預（C）組，每組10只，分別給予標準、標準+1%膽固醇、標準+1%膽固醇+1%GSPE的顆粒飼料，每只每天100～120g。各組均能按時吃完，即B組每只每天攝入膽固醇1～1.2g，C組每只每天除攝入與B組同量膽固醇外，再攝入1～1.2

　　gGSPE進行預防。各組兔均飼喂12周。1.2.2 標本獲取 各組兔均于實驗開始前1天實驗第1、2、4、8、12周末獲取血液標本。清晨空腹稱量體重后，經耳中動脈采血，待自凝后，以4000r/min×10min離心，留取血清用于測定ICAM-1、VCAM-1和E-選擇素。所有血樣均保存于-20℃冰箱待測。12周末取血后處死，取主動脈作病理形態學觀察。

　　1.3 檢測指標與方法 血清ICAM-1、VCAM-1和E-選擇素含量按試劑盒說明書方法進行測定。

　　1.4 數據處理與統計 所有實驗數據采用SAS8.2軟件進行統計分析，結果以均數±標準差（ˉx±s）表示，各組間均數比較用混合式模型的方差分析（Proc Mixed）。

　　2 結果

　　2.1 血清粘附分子水平變化 血清ICAM-1、VCAM-1、E-選擇素水平變化分別見表1～3、圖1～3。

　　表1 各組新西蘭大白兔血清ICAM-1（μg/L）水平 （ˉx±s）（略）

　　注:與A組同時間點比較 △ P<0.05; △△ P<0.01;與B組同時間點比較 ˇ P<0.05

　　表2 各組新西蘭大白兔血清VCAM-1（μg/L）水平 （ˉx±s）（略）

　　注:與A組同時間點比較 △ P<0.05， △△ P<0.01

　　圖1 各組兔血清ICAM-1水平變化 圖2 各組兔血清VCAM-1水平變化

　　圖3 各組兔血清E-選擇素水平變化

　　從表1、圖1可以看出，實驗前，各組ICAM-1基線水平一致;實驗后，與A組比較，B組在第1周即顯著升高（P<0.05），并一直維持至實驗結束，C組只在第8周時顯著升高（P<0.05），其余時間與A組差異無顯著性;與B組比較，C組在12周時顯著降低（P<0.05）。以上結果表明，高膽固醇可使ICAM-1水平持續升高，而GSPE具有降低ICAM-1作用。

　　從表2、圖2可以看見，實驗前，各組VCAM-1基線水平一致;實驗后，與A組比較，B組在第1周即顯著升高（P<0.0001），直至實驗結束，C組在第2周時顯著升高（P<0.01），直至實驗結束;與B組相比，C組1周時顯著降低（P<0.01），直到實驗結束。以上結果表明，高膽固醇使VCAM-1水平持續升高，而GSPE具有降低VCAM-1作用。

　　從表3、圖3可以看出，實驗前，各組E選擇素基線水平一致;實驗后，與A組比較，B組在第1周即顯著升高（P<0.05），直至實驗結束，C組直至12周時才比A組顯著升高（P<0.05）;與B組比較，C組無顯著變化，具有可比性（P>0.05）。以上結果表明，高膽固醇使E-選擇素水平持續升高，GSPE雖然具有降低其水平趨勢，但未達到統計學差異。

　　2.2 主動脈病理變化 見圖4～6。由圖4～6可見正常對照組兔主動脈內膜光滑，無脂質沉積;高脂模型組兔主動脈內膜面有大量白色斑塊，大小不等，多分布于血管分叉周圍，有的融合成片，其長軸多與主動脈長軸平行，以主動脈弓處病變最重，有的部位整個內膜彌漫性增厚，AS病變非常明顯;GSPE干預組兔主動脈只在血管分叉周圍發現了少數較小的白色脂質斑塊，其它部位的內膜光滑，無脂質沉積，AS病變程度明顯減輕。

　　3 討論

　　從1865年His提出內皮（endothelium）的概念到1980年Furchgott等揭示內皮依賴性血管舒張的現象，內皮僅被認為是血液與血管壁之間的物理屏障。現已證明血管內皮是體內最大的內分泌及旁分泌器官，是位于血液與血管壁之間的一個多功能界面。內皮細胞兼有感覺與效應功能，其表面有感知機械力、炎性信號和多種活性因子的受體，也能夠合成并分泌數十種因子如凝血/纖溶因子、血管活性因子、生長因子、細胞因子以及粘附分子等，對循環系統的穩態平衡有重要調節作用。評價血管內皮功能對于心血管疾病的早期診斷及預后和療效判斷均具有重要意義。內皮將成為治療和預防心血管疾病的新靶點。

　　AS是一種嚴重威脅人類生命和健康的重大疾病，是心腦血管疾病的重要病理基礎，是發達國家人口死亡的主要原因，在發展中國家發病率和病死率也越來越高，因此AS發病機制和抗AS藥物一直是研究的熱點。AS長期以來都被認為是一種老年性、退行性疾病，但近年研究發現，AS實 質上是大、中動脈內膜的慢性炎癥。炎癥從AS斑塊的形成，生長到破裂，構成了其全病程的基礎[2] 。故隨著近年來人們對AS本質認識的不斷深化，逐漸提出了抗炎、保護內皮的新治療策略。

　　目前，內皮的保護策略主要有清除或拮抗損傷因素，應用細胞保護劑，激活內源性保護物質/機制等。抗損傷措施，包括糾正缺血缺氧、調血脂、降血壓、糾正高同型半胱氨酸血癥、抗粘附、抗炎癥、應用鈣拮抗劑、血管緊張素轉換酶抑制劑（ACEI）與AT1受體阻斷劑等，其中抗粘附治療是內皮保護的新途徑之一，已進入臨床試驗。動物實驗表明，以單克隆抗體、反義核酸或其它拮抗劑（例如NF-κB拮抗劑）阻斷內皮細胞粘附分子的表達或功能，能夠顯著減輕心血管組織損傷［3］ 。外源性細胞保護劑包括抗氧化劑，如SOD、過氧化氫酶、維生素E和C等，其內皮保護效應已在臨床得到證實。由于SOD和過氧化氫酶半衰期短，因此，尋找新的外源性細胞保護劑是目前研究的熱點之一。

　　在AS斑塊的形成過程中，單核細胞對血管內皮細胞的粘附是前者進入內皮下間隙進而轉變為泡沫細胞的關鍵步驟。研究發現，AS患者的粘附分子表達增強。Sen CK等［4］ 應用TNF-α處理的人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）研究了GSPE對粘附分子表達的影響，發現低濃度（1～5mg/ml）的GSPE即可使經TNF-α處理的HUVEC的血管細胞粘附分子-1表達下調。在他們同時進行的一項細胞與細胞共同培養的研究中，發現GSPE可使內皮細胞與白細胞的相互作用減弱。提示粘附分子表達下調可能是GSPE抗AS的分子生物學機制之一。

　　我們實驗室一直進行GSPE抗AS的免疫學研究，發現GSPE具有抗LDL氧化修飾 ［5］ 、調節血脂 ［6］ 、降低血清C反應蛋白水平、降低內皮炎癥水平等作用。本次觀察了GSPE對血清粘附分子的影響，結果顯示，高膽固醇使ICAM-1、VCAM-1和E-選擇素水平持續升高，而GSPE能使其水平降低，而接近于正常水平，表明GSPE具有抗內皮粘附作用。我國是葡萄的主產地，資源豐富，品質優良，具有巨大的開發價值。從廢棄的葡萄籽中提取的原花青素，具有調血脂、抗氧化、抗炎、抗粘附等內皮保護作用，因此，深入研究其作用機制，將GSPE應用于AS防治，對于增進人民健康，促進經濟和社會發展，具有重大意義。（參考文獻：葡萄籽原花青素降低動脈粥樣硬化兔內皮粘附分子水平，馬亞兵，中華現代中西醫雜志2004年第2卷第11期）

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