動脈粥樣硬化發病中冠狀動脈內源性一氧化碳及血紅素氧化酶-1的變化

　　近年的研究發現內源性一氧化碳（CO）是一種新型的信使分子。作為內源性一氧化碳合成的限速酶和關鍵酶，即血紅素氧化酶（Heme Oxygenase，HO）已被證實幾乎分布于所有器官和組織 ［1］ ，HO-1和CO在動脈粥樣硬化發生機制中的作用，目前罕見報告。本研究采用逆轉錄多聚酶鏈式反應（RT-PCR）、分子原位雜交、免疫組織化學染色等多項指標，從不同側面研究CO及其合成酶HO-1在動脈粥樣硬化發病中的作用機制，旨在為動脈粥樣硬化的發病機理及防治探索一條新的途徑。

　　1 材料和方法

　　1.1 動脈粥樣硬化的動物模型制備及分組 實驗動物:新西蘭大白兔，雄性，120只，體重0.5～1.1kg，實驗總時間為12周，由本校動物所提供。采用隨機法分為5組（對照組及四個實驗組），每組24只，分籠飼養。對照組食用基礎飼料，而實驗組添加膽固醇粉1g/天/只，于傍晚給藥。于喂養的第2、4、8、12周分別將各實驗組及對照組的兔頸動脈放血處死。

　　1.2 HO-1免疫組化染色（SP法） 將心肌及冠狀動脈進行石蠟包埋、切片厚度為6μm。HO-1單抗的稀釋度為1/250，其余按常規步驟進行。用PBS代替抗體作為陰性對照。陽性為棕黃色。

　　1.3 HO-1mRNA的原位雜交 pRHO1（HO-1）cDNA質粒由日本Toshisuke教授惠贈。經過轉化、擴增、抽提與純化、酶切鑒定后，用寶靈曼的地高辛標記檢測試劑盒進行標記。將心肌及其冠狀動脈的石蠟標本切片，厚度為6μm。按常規步驟進行。陰性對照:（1）雜交前用RNase100μg/ml37℃1h預處理組織（消化mRNA）切片。（2）用未標記的pRHO1cDNA探針進行雜交反應。

　　1.4 反轉錄聚合酶鏈式反應測定冠狀動脈HO-1mRNA表達 總RNA提取采用異硫氰酸胍一步法。采用顯微分離法分離冠狀動脈，利用Promega提供的試劑進行提取冠狀動脈總RNA。反轉錄聚合酶鏈式反應:采用隨機引物法。聚合酶鏈式反應擴增HO-1和β-肌動蛋白（β-actin）特異性片段。擴增HO-1cDNA特異性片段的引物是根據Toshisuke發表的鼠HO-1特異性引物的序列確定的。上游引物為5′-GAATTCAGCATGCCCCAGGTGGT-3′，下游引物為5′-TCTAGACTAGCTGGATGTTGAGCAGGA-3′。在進行RT-PCR的同時擴增鼠β-actin用作內參照，保證每次實驗的相對可比性，擴增鼠β-actin特異性片段的上游引物為5′-GCG GGA AAT CGT GCT ACA TT-3′，下游引物為5′-GAT GGA GTT GAA GGT AGT TTC GTG-3′。94℃1min，50℃1min，72℃1min。首輪循環95℃2min，最后72℃延伸5min，共進行30次循環。然后進行1%瓊脂糖電泳分析。

　　1.5 HO活性測定 冠狀動脈分離后，按文獻方法 ［2］ 測定HO活性。根據在464nm和530nm處的光吸收推算出，膽紅素的消光系數為401/mmol/Lcm。 蛋白定量采用考馬斯亮藍法。

　　1.6 CO含量測定 按文獻方法 ［3］ 測定CO活性。

　　1.7 放免法測定冠狀動脈cGMP含量 按 125 I標記試劑盒說明書進行。

　　1.8 統計學方法 實驗數據以均數±標準差表示，采用Microsoft Excel97數據分析統計程序進行單因素方差分析及部分指標相關分析。

　　2 結果

　　2.1 冠狀動脈HO-1mRNA的表達 原位雜交法檢測顯示在正常情況下冠狀動脈HO-1mRNA表達較少，隨著實驗性動脈粥樣硬化的發展，在實驗組第2周（圖1），12周（圖2）內皮細胞HO-1mRNA的表達逐漸增強，陰性對照組中冠狀動脈內皮細胞呈陰性反應。

　　2.2 冠狀動脈HO-1免疫組織化學染色的變化 對照組冠狀動脈內皮細胞在HO-1呈弱陽性反應、第二周實驗組中冠狀動脈內皮細胞的HO-1呈局灶性弱陽性反應，但在心肌間質毛細血管內皮及心肌細胞索周膜內呈陽性;第四周實驗組的冠狀動脈內皮細胞內HO-1呈弱陽性反應，冠狀動脈分支內皮細胞呈陽性或弱陽性反應;部分心肌細胞呈片狀陽性反應;第八周實驗組中冠狀動脈內皮細胞、心內膜內皮細胞、心肌小血管及毛細血管內皮細胞和心肌細胞索周膜的HO-1呈陽性反應;第十二周實驗組中冠狀動脈內皮細胞的HO-1呈強陽性（圖3），而心內膜內皮細胞也呈強陽性反應。陰性對照:冠狀動脈內皮細胞HO-1呈陰性。

　　2.3 冠狀動脈HO-1mRNA表達圖像分析、HO活力（pmol/mg.pr/h）、CO（μg/mg）及cGMP（pmol/L）濃度變化 見表1。 表1 冠狀動脈血紅素氧化酶-1mRNA表達圖像分析、血紅素氧化酶活力（pmoL/mg.pr/h）、內源性一氧化碳（μg/mg）及鳥苷酸環化酶（pmol/L）濃度變化 （略）

　　注:與前一時相點相比: a P<0.01

　　RT-PCR檢測到，第二周時HO-1mRNA的表達開始增加，隨著動脈粥樣硬化的逐漸進展，mRNA的表達量逐漸增加，第12周時mRNA的表達仍較高。β-actin的表達在各時相點之間表達量無明顯變化（圖4略）。從表可見隨著動脈粥樣硬化的發展冠 狀動脈HO的活性、CO含量及cGMP也逐漸增高，并且每一時相點與前一時相點相比呈非常顯著性增加（P均<0.01）。相關分析表明內源性一氧化碳的含量和cGMP的濃度呈非常明顯的正相關（r=0.99259，P<0.01）。

　　3 討論

　　心血管疾病死亡率在我國疾病死亡率居第一或第二位，其中冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的發病率與死亡率在逐年上升。盡管150年來，關于動脈粥樣硬化的發病機制已提出許多學說，但很多問題仍不清楚。目前國外研究表明CO在調節細胞功能和細胞相互作用方面起著重要的作用。實驗已經證明在腦中CO是一種新型的神經信使，而HO-1的可被誘生的性質使其不僅在機體正常生理狀態下，而更主要在機體的病理狀態或應激狀態下亦發揮作用 ［4］ 。HO-1和CO在動脈粥樣硬化發病機制中的作用，目前罕見報道。我們通過免疫組化染色和原位雜交研究發現HO-1主要存在于冠狀動脈和主動脈的內皮細胞層 ［5，6］ ，并隨著主動脈壁和冠狀動脈的內皮和內皮下動脈粥樣硬化發病變逐漸加重，HO-1mRNA表達和蛋白表達呈動態進行性增強的趨勢。1998年5月Wang應用原位雜交在人和動物中研究了HO-1在主動脈粥樣硬化損傷部位的分布狀態，也發現HO-1mRNA主要分布于內皮細胞層和損傷部位增厚內膜的泡沫細胞/巨噬細胞 ［7］ 。這與我們在主動脈和冠狀動脈上所進行原位雜交的結果是一致的 ［5，6］ 。我們從RT-PCR結果也觀察到隨著動脈粥樣硬化的發展冠狀動脈HO-1mRNA的表達強度逐漸增高。這與原位雜交所觀察到的結果是一致的。國外一些研究者在其他疾病的生理和病理過程中也觀察到HO-1在疾病的不同時期其基因和功能會有所改變。我們在冠狀動脈HO-1的功能研究也發現，隨著動脈粥樣硬化的發展HO-1活性、CO的濃度和cGMP的含量逐漸增高。眾所周知內皮素與動脈粥樣硬化的發展有密切的關系。1995年Toshisuke報道證實cGMP增多抑制ET的產 生 ［8］ 。我們的研究和國外的研究均表明，CO含量增高導致cGMP增高。（參考文獻：動脈粥樣硬化發病中冠狀動脈內源性一氧化碳及血紅素氧化酶-1的變化，張清華， 中華現代內科學雜志2004年第1卷第1期 ）

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