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全腦缺血大鼠海馬CA1 區神經元凋亡和神經生長因子的保護作用

熊建瓊,文　亮　　(第三軍醫大學附屬西南醫院急救部ICU )

 

提　要: 目的　研究大鼠全腦缺血再灌注后海馬CA1 區P75NTR、Bcl22、Bax 表達及細胞凋亡的變化及神經生長因子(NGF) 對它們的影響,進一步探討該區神經元短暫腦缺血后產生凋亡及NGF 對神經元保護作用的可能機制。方法　通過四血管閉塞法建立大鼠全腦缺血2再灌注模型,側腦室注射NGF ,免疫組織化學法檢測P75NTR、Bcl22、Bax 表達的情況,TUNEL 法檢測神經元凋亡。

 

結果　對照組海馬CA1 區無P75NTR、Bcl22 陽性染色和凋亡細胞,可見少量Bax 表達,再灌注后該區Bcl22 始終陰性表達,Bax 則表達增加,出現P75NTR 陽性表達和細胞凋亡;在NGF 給藥組,再灌注后海馬CA1 區Bcl22 出現陽性染色,而Bax 及P75NTR 的表達則明顯降低,細胞凋亡亦明顯減少。結論　再灌注后海馬CA1 區P75NTR、Bax 的表達增加可能是神經元產生凋亡的機制之一,NGF 抑制腦缺血后細胞凋亡的作用可能是通過對其受體的調節,從而調節Bcl22 和Bax 的表達來實現的。

 

　Neuronal apoptosis and protective effect of nerve growth factor in hippocampal CA1 re2

gion after cerebral ischemia in rats

 

　　Abstract : Objective 　To investigate the mechanism underlying apoptosis and protective effect of nerve growth factor (NGF) in hippocampal CA1 region after cerebral ischemia/ reperfusion. Methods 　Wistar rats were inflicted with four2vessel occlusion for global ischemia , and those inNGF group were given intraventricular injection of NGF after ischemia. Immunohistochemistry staining was used to detect P75NTR , Bcl22 and Baxnd TUNEL method to detect apoptosis. Re sults 　The expression of Bax was positive , while theapoptosis and the expressions of P75NTR and Bcl22 were negative in normal control. After ischemia/ reperfusion , the expression of Bcl22 was still negative , while the expression of P75NTR and Bax increased and reached its summit in day 3. TUNEL2positive neurons were seen in day 2 and reached a peak in day 3. In NGF group , the expression of Bcl22 was increased , while the expression of Bax , P75NTR and TUNEL positive cells were obviously decreased. Conclusion 　These findings suggest that the increased expression of P75NTR and Bax in hippocampal CA1 region after cerebral ischemia/ reperfusion may be one of the main reasons for apoptosis after ischemia. Intraventricular NGF might have protective effect on neuronal apoptosis after cerebral ischemia via regulation the expression of Bcl22 and Bax by regulated NGF receptor.

 

 

 

 

　　近年來的一些研究顯示細胞凋亡是腦缺血再灌注后神經細胞損傷中與細胞壞死不同的一種形式,許多

細胞因子對神經細胞凋亡起調控作用,其中神經生長因子(NGF) 與神經細胞凋亡的關系十分密切。本實驗

應用大鼠全腦缺血再灌注模型,觀察全腦缺血再灌注后海馬CA1 區P75NTR、Bcl22、Bax 表達的變化及神經

元凋亡的情況,以及側腦室注射NGF 后對它們的影響,旨在進一步探討缺血致神經元凋亡的機制以及NGF 對缺血受損神經元保護作用的可能機制,為臨床腦缺血損傷后的治療提供實驗指導。

1 　材料與方法

1. 1 　動物模型

　　健康雄性Wistar 大鼠,體重250～300 g ,由第三軍醫大學實驗動物中心提供。使用隨機數字表法將大鼠隨機分為對照組(10 只) 、腦缺血組( Ⅱ) 及缺血給藥組( Ⅲ) 。腦缺血組大鼠采用改良Pulsinelli 法[1 ]制備四血管閉塞大鼠全腦缺血10 min 再灌注模型;缺血給藥組大鼠在燒灼椎動脈后,按照Bures 圖譜于側

腦室(A 115 ,L 115 ,H 310) 埋置不銹鋼導管(外徑016 mm) 一個,于缺血后5 min ,1 d , 2 d 側腦室內注射NGF 10μg ;對照組僅暴露雙側翼孔及頸動脈,各血管不行閉塞,側腦室埋管,注入等量生理鹽水。再灌注時間為1、2、3、5、7 d ,每個時相點10 只大鼠。

 

1. 2 　取材切片

　　大鼠在相應時間點殺死,經左心室灌注,生理鹽水沖凈血液后,以4 ℃4 % 多聚甲醛液灌注固定,灌注后迅速斷頭取腦。冷凍切片的準備:將腦組織置于20 %蔗糖液中(4 %低聚甲醛配制)12～24 h(4 ℃) ,冷凍切片,片厚30μm。石蠟切片:將腦組織置灌注液中后固定6 h(4 ℃) ,常規石蠟包埋、切固,片厚5μm。

1. 3 　海馬CA1 區神經元P75NTR 的免疫組織化學染色

　　將冷凍切片與P75 單抗1∶50 , (購自Calbiochem 公司) 4 ℃孵育過夜,按ABC 試劑盒提供的方法操作(ABC 試劑盒購自中山試劑公司) ,DAB 顯色,甲基綠復染,封片,觀察。

1. 4 　海馬CA1 區神經元Bax 和Bcl22 的免疫組織化學染色

　　石蠟切片經微波爐修復抗原10 min ,分別與bcl22 抗血清1∶100、bax 抗血清1∶800 , (均購自中山試劑公司) 4 ℃孵育過夜,

 

按ABC 試劑盒提供的方法操作(ABC 試劑盒購自中山試劑公司) ,DAB 顯色,用蘇木精復染,封固,觀察。

1. 5 　TUNEL 法原位檢測細胞凋亡

　　應用熒光標記的終末脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP 缺口末端標記法(TdT2mediated dUTP nick end labelling ,TUNEL) , 按凋亡試劑盒所示步驟進行染色,DAB 顯色,封固,觀察。

1. 6 　統計學處理

　　免疫組織化學染色結果和TUNEL 法結果用CAMIS 007 型真彩醫學圖像分析系統進行處理,每張切片隨機取5 個視野,以積分光密度表示,取5 個視野均值作為結果,實驗結果以.x ±s 表示。圖像分析結果進行雙因素方差分析。

2. 1 　P75NTR 的免疫組織化學變化

　　對照組,海馬CA1 區神經元未見P75NTR 染色,腦缺血再灌流后第1 d ,該區神經細胞即有P75NTR 的表達,與對照組相比有非常顯著差異( P < 0101) ,并逐漸增加,第3 天時達峰值,見圖1 ,隨后逐漸下降,但至再灌流后7 d ,仍可見到陽性染色。在NGF 給藥組,未能阻止再灌流后P75NTR 的表達,與對照組相比有非常顯著差異( P < 0101) ,但與缺血組相比,卻明顯降低了其表達水平,與缺血組相比有非常顯著差異( P < 0101) 。

 

 

染色最強　(ABC ×200)

Fig 1 　Maximal strongly2stained P75NTR positive neurons in hip2pocampal CA1 region in day 3 after reperfusion 　(ABC ×200)

2. 2 　海馬CA1 區Bcl22 的變化

　　對照組,海馬CA1 區未見Bcl22 陽性染色存在,再灌流后各時相點均未見Bcl22 的陽性染色;在NGF 給藥組,再灌流后1 d海馬CA1 區神經元即可見到有Bcl22 的表達,與缺血組相比有非常顯著差異( P < 0101) ,并隨時間延長逐漸增高,于第3 天達到高峰,見圖2 ,與缺血組相比有非常顯著差異( P < 0101) ,之后逐漸降低,于再灌流后7 d 消失。

2. 3 　海馬CA1 區Bax 的變化

　　對照組鼠海馬CA1 區可見到少量Bax 陽性染色的神經元存在,缺血再灌流后1 d Bax 表達即輕度增加,其后隨再灌流時間的延長逐漸升高,至第3 天Bax 表達最高,見圖3。與對照組相比有非常顯著差異( P < 101) ,之后逐漸下降,于第7 天恢復至對照組水平。NGF 給藥組,并不能阻止Bax 的升高,與對照組相比有顯著差異( P < 0101) ,但卻明顯降低了Bax 的升高程度,與缺血組相比有非常顯著差異( P < 0101) 。

 

 

圖2 　缺血給藥后第3 天海馬CA1 區Bcl22 陽性染色最強　(ABC×200)

Fig 2 　Hippocampal CA1 neurons with strongest Bcl22 staining in

NGF group in day 3 after reperfusion 　(ABC ×200)

 

 

圖3 　再灌注后第3 天海馬CA1 區Bax 陽性染色最強　　(ABC ×200)

Fig 3 　Most strongly Bax stained neurons in hippocampal CA1 regionin day 3 after reperfusion 　(ABC ×200)

 

2. 4 　海馬CA1 區細胞凋亡的觀察

　　對照組海馬CA1 區無細胞凋亡存在,缺血再灌注2 d 可見海馬區出現凋亡細胞,與對照組相比有非常顯著差異( P <0101) ,但反應較弱,至第3 天時凋亡細胞數目最多,染色最強,見圖4。其后逐漸減弱,第7 天消失;NGF 給藥組未能阻止再灌注后凋亡的發生,與對照組相比有非常顯著差異( P < 0101) ,但卻明顯減少了凋亡細胞的數目,與缺血組相比有非常顯著差異( P < 0101) 。

 

 

圖4 　再灌注后3 d 海馬CA1 區可見大量細胞凋亡　(TUNEL ×200)

Fig 4 　Massive apoptotic neurons in hippocampal CA1 region in day 3after reperfusion 　(TUNEL ×200)

 

表1 　大鼠全腦缺血再灌注及NGF 給藥后海馬CA1 區P75NTR、Bcl22、Bax 及細胞凋亡的變化( .x ±s)

Tab 1 　Expressions of P75NTR, Bcl22 , Bax and neural apoptosis and effect of NGF after cerebral ischemia/ reperfusion( .x ±s)

Time after cerebral ischemia/ reperfusion

Target Group Control

1 d 2 d 3 d 5 d 7 d

P75NTR Ⅱ 0 11. 58 ±2. 70 33 19. 24 ±2. 76 33 27. 80 ±2. 25 33 7. 11 ±1. 31 33 4. 70 ±0. 72 33

Ⅲ 0 7. 52 ±1. 19 △△33 9. 23 ±2. 11 △△33 11. 44 ±0. 92 △△33 6. 3 ±1. 44 33 4. 54 ±1. 93 33

Bcl22 Ⅱ 0 0 0 0 0 0

Ⅲ 0 2. 38 ±0. 39 △△33 4. 11 ±1. 14 △△33 6. 05 ±0. 36 △△33 1. 69 ±0. 34 △△33 0

Bax Ⅱ 2. 20 ±0. 18 7. 43 ±0. 72 3 12. 48 ±0. 97 33 21. 86 ±2. 20 33 4. 69 ±0. 53 1. 96 ±0. 87

Ⅲ 2. 20 ±0. 18 4. 37 ±0. 41 △ 8. 69 ±1. 42 △3 12. 36 ±1. 33 △△33 2. 61 ±0. 40 2. 44 ±0. 57

Apopsis Ⅱ 0 0 7. 88 ±1. 58 33 37. 49 ±6. 82 33 2. 21 ±0. 17 33 0

Ⅲ 0 0 4. 73 ±0. 5 △33 25. 21 ±6. 65 △△33 1. 52 ±0. 36 33 0

Ⅱ: Group of cerebral ischemia/ reperfusion ; Ⅲ:Group of intraventricular injection of NGF after ischemia ; 3 : P < 0105 , 3 3 : P < 0101 vs Control ;

△: P < 0105 , △△:P : < 0101 vs Group Ⅱ

 

 

　　缺血性腦損傷的機制和防治一直是該領域研究的熱點。由于海馬CA1 區神經元對缺血具有選擇性敏

感,短暫性腦缺血即可導致該區神經元的遲發性死亡,所以海馬CA1 區成為缺血性腦損傷研究的一個典型

腦區。近年來隨著研究的深入,人們發現短暫腦缺血后海馬CA1 區出現神經元的死亡與細胞凋亡密切相

關,有學者認為短暫腦缺血后海馬CA1 區神經元出現的遲發性死亡是細胞凋亡的過程。缺血致神經元凋亡

的確切機制目前還不清楚。神經生長因子對神經元具有營養和保護作用,可減輕腦缺血后海馬組織的遲發

性神經元死亡。

3. 1 　TUNEL 法檢測凋亡細胞的特異性

　　檢測細胞凋亡的方法很多,其中,TUNEL 法就是用終末脫氧核苷酸轉移酶,將生物素、熒光素或地高辛

標記的核苷( 如Biotin2dUTP ,DIG2dUTP , Fluorescene2dUTP) 聯結到DNA (單鏈或雙鏈) 的3′2 OH 末端,從而檢測凋亡的方法。凋亡的片段DNA 含3′2 OH 末端,而壞死的DNA ,因被溶酶體核酸酶溶解,故DNA 的末端5′2 OH ,不能用TUNEL 法檢出,TUNEL 法具有檢測快,特異性強,靈敏度高,可以原位檢測細胞凋亡等優點,

是目前最受青睞的方法之一。所以本實驗采用TUNEL 法檢測細胞凋亡。

3. 2 　再灌注后海馬CA1 區P75NTR 表達及細胞凋亡的變化

　　P75NTR 是低親和力神經營養因子受體(Neu2rotrophin Receptor ,NTR) ,能與目前已知的神經營養因

子家族的所有成員以低親和力結合,其在發育中的神經系統中廣泛存在,但在生后水平降低,至成年時,中樞神經的前腦基底、蒼白球、尾狀核有表達,但海馬區無P75NTR 表達。有實驗發現直接的組織損傷能導致P75NTR 的表達。如在成年大鼠小腦損傷后1 d ,小腦Purkinje 細胞就出現P75NTR 的再表達[2 ] 。然而,在腦缺血/ 再灌注損傷中它是否有表達及變化規律卻研究甚少。在本實驗中,我們觀察了大鼠全腦缺血10 min再灌注1、2、3、5、7 d 的大鼠,實驗顯示:在對照組海馬CA1 區神經元無P75NTR 表達,此時無細胞凋亡存在,再灌注后1 d 就可見到P75NTR 的陽性染色,再灌注后2 d P75NTR 表達增強,出現細胞凋亡,再灌注后3 dP75NTR 表達達峰值,細胞凋亡亦達峰值,之后P75NTR的表達及細胞凋亡均逐漸減弱。近年來研究發現,P75NTR 屬腫瘤壞死因子受體家族,在無NGF 高親和力受體trkA 存在時,它具有介導細胞凋亡的作用,而且凋亡的水平與P75NTR 的表達水平呈正相關[3 ] ,但其介導細胞凋亡的詳細機制還不清楚。而正常成體鼠和缺血后鼠海馬CA1 區均無trkA 表達[4 ] ,因此,腦缺血再灌注后海馬CA1 區出現P75NTR 的單獨表達,此時它作為死亡信號分子,可能參與了該區細胞凋亡的發生。再灌注后海馬CA1 區P75NTR 表達增加的機制目前還不清楚,尚需進一步研究。

3. 3 　再灌注后海馬CA1 區Bcl22、Bax 及細胞凋亡的變化

　　Bcl22 和Bax 都是與凋亡密切相關的基因,它們的作用是相互拮抗的[5 ] ,Bcl22 能抑制細胞凋亡,而Bax

則介導細胞凋亡。當bcl22 過量時,形成Bcl22 同源二聚體,細胞受到保護;當Bax 過量時,形成Bax 同源二聚體,細胞則趨向凋亡。Bcl22 的抗凋亡活性是通過與Bax 組成異源二聚體,從而阻止Bax 介導凋亡的作用。因此,在凋亡刺激因子作用下,這兩種蛋白的比例決定了細胞是凋亡還是存活。本實驗顯示,對照組海馬CA1 區無Bcl22 陽性染色和凋亡細胞,可見少量Bax 表達,大鼠全腦缺血再灌注后該區Bcl22 始終陰性表達,而Bax 則表達增加,并于再灌注后第3 天達峰值,細胞凋亡于再灌注后第2 天出現,3 d 達峰值。提示再灌注后海馬CA1 區Bcl22 始終陰性表達,而Bax 則表達增加,可能參與了該區神經元凋亡的發生。

3. 4 　NGF 對再灌注后海馬CA1 區神經元凋亡的保護作用

　　NGF 是一種靶源性細胞因子,對神經細胞的生存、發育、修復及神經功能的維護具有重要的作用,既往的

研究表明,NGF 能顯著減輕缺血后海馬CA1 區的DND ,本實驗顯示側腦室注射NGF 后,海馬CA1 區Bcl22 表達明顯增加, P75NTR、Bax 表達明顯降低,細胞凋亡明顯減少,表明NGF 可能通過對P75NTR 及Bcl22、Bax 的調節而抑制腦缺血后神經細胞凋亡。

　　外源性NGF 對缺血后神經細胞凋亡的調控機制目前尚不清楚。有研究顯示撤除血清后的細胞凋亡能被NGF 抑制,同時這些細胞的Bcl22 顯著增加,而Bcl22的反義核酸能抑制NGF 誘導的Bcl22 的增加, 同時NGF 對細胞的保護作用也被取消[7 ] 。NGF 必須與受體結合才能啟動其生物效應,而NGF 受體分為高親和力受體trkA 和低親和力受體P75NTR ,P75NTR 的功能復雜,在trkA 存在時,它協同trkA 共同轉導NGF 的生物效應,促進神經元的存活和生長;當trkA 不存在時它則具有介導細胞凋亡的作用。在正常成體鼠腦海馬組織內不存在trkA 和P75NTR ,缺血再灌注后仍無trkA的表達,而P75NTR ,如實驗所示,出現陽性表達,而在側腦室注射NGF ,NGF 可上調P75NTR 及trkA 水平[6 ] ,使神經元對NGF 具有反應性。結合本實驗,我們推測,NGF 可能通過對其受體trKA 及P75NTR 的調節使神經元對NGF 具有反應性,而NGF 與受體結合后通過某種途徑上調Bcl22 的表達,抑制Bax 的表達,從而抑制了神經元凋亡的發生。而我們實驗發現在側腦室注射NGF 后P75NTR 水平比缺血組降低,可能是注射NGF 后神經元損傷減輕,P75NTR 的升高程度降低, 及NGF 上調其受體表達,這兩方面綜合效應的結果。

對于NGF 與受體結合后是通過何種途徑來調節Bcl22和Bax 表達的,還有待進一步研究。

參考文獻:

[ 1 ] Pulsinell WA , Brierley J B. A new model of bilateral hemispheril ischemiain the unanesthetized rat [J ] . Strike ,1997 ,10 (0) :267 - 269.

[2 ] Martinez M R , Fernandez A P , Bentura ML , et al . Subcellular localiza2tion of low2affinity nerve growth factor receptor immunoreactive protein inadult rat purkinje cells following traumatic injury[J ] . Exp Brain Res ,1998 ,119(1) :47 - 57.

[3 ] Effert A , Sieverts H , Ikegaki N , et al . P75 mediated apoptosis in neurob2lastoma cells is inhibited by expression of trkA[J ] . Med Pediatr Onclo ,2000 ,35 (6) :573 - 576.

[4 ] Merlio J P , Ernfors P , Kokaia Z , et al . Increased production of the TrkAprotein tyrosine kinase receptor after brain insults [J ] . Neuron ,1993 ,10(2) :151 - 174.

[5 ] Stanley J K. Regulators of cell death[J ] . TIG,1995 ,11(3) :101.

[6 ] Kitzman P H , Perrone TN , Lemaster AM, et al . Level of p75 receptor ex2pression in sensory ganglia is modulated by NGF level tn the target tissue[J ] . J Neurobiol ,1998 ,35 (3) :258 - 270.

[7 ] Katoh S , Mitsui Y, Kitani K, et al . Nerve growth factor rescues PC12cells from apoptosis by increasing amount of Bcl22[J ] . Neurosci Lett ,1997 ,23(2) :71 - 74.