漢防己甲素片對(duì)白血病耐藥細(xì)胞株K562/A02核因子κB表達(dá)的影響

導(dǎo)讀：白血病又稱“血癌”，是造血系統(tǒng)的惡性增殖性疾病，該病居年輕人惡性疾病中的首位，是嚴(yán)重威脅兒童健康的疾病之一。白血病是全身性腫瘤，以化療為主，根據(jù)白血病細(xì)胞不成熟的程度和白血病的自然病程，分為急性和慢性兩大類。研究表明，高輻射環(huán)境下、接觸化學(xué)原料、濫用藥物等是引發(fā)白血病的因素。因此，遠(yuǎn)離誘因是防治的最佳手段。隨著分子生物學(xué)、生物遺傳學(xué)的進(jìn)展，新療法、新藥物以及中藥的使用，使白血病預(yù)后得到極大的改觀。

    腫瘤耐藥是當(dāng)今腫瘤治療的一大難題，一直是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。腫瘤耐藥的發(fā)生是多種機(jī)制共同作用的結(jié)果，其機(jī)制之一是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)因子導(dǎo)致凋亡抵抗，如活化NF��κB、Bcl��2、突變型p53等。克服和干預(yù)腫瘤細(xì)胞耐藥是提高腫瘤療效的重要手段。中藥漢防己科植物粉防己具有行水和瀉下焦?jié)駸岬墓πВ�用于治療水腫臌脹、濕熱腳氣、手足痙攣等。漢防己甲素（tetrandrine, Tet）是從粉防己塊根中提取的生物堿，研究證實(shí)Tet是天然的非選擇性鈣通道阻滯劑，又是鈣調(diào)蛋白拮抗劑，臨床用于逆轉(zhuǎn)多藥耐藥（multiple drug resistance, MDR）時(shí)耐受性較好，無(wú)明顯副作用。核因子κB（nuclear factor�瞜appaB，NF��κB）是分布和作用十分廣泛的真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其與腫瘤發(fā)生發(fā)展、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移以及腫瘤多藥耐藥有密切關(guān)系，可能成為提高腫瘤化療效果的治療新靶點(diǎn)。

    本課題組既往的實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，Tet能有效逆轉(zhuǎn)慢性粒細(xì)胞白血病急性紅白血病變細(xì)胞耐藥株K562/A02對(duì)化療藥物柔紅霉素的耐藥性；它逆轉(zhuǎn)耐藥可能與下調(diào)mdr1基因及P�蔡堑鞍祝≒glycoprotein, Pgp）的表達(dá)，改變細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度［Ca2＋］i，下調(diào)bcr/abl基因等有關(guān)。為進(jìn)一步了解該藥逆轉(zhuǎn)耐藥的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)將檢測(cè)Tet對(duì)NFκB表達(dá)的影響，為該藥作為耐藥逆轉(zhuǎn)劑應(yīng)用于臨床提供理論依據(jù)。

    材料與方法

    1.1 細(xì)胞株及來(lái)源 人慢性粒細(xì)胞白血病急性紅白血病變細(xì)胞株K562購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。人慢性粒細(xì)胞白血病急性紅白血病變阿霉素（adriamycin, ADM）耐藥細(xì)胞株K562/A02購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病研究所。

    1.2 主要儀器及試劑 免疫組化SP檢測(cè)試劑盒，為北京中山生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；蛋白提取試劑盒為Active Motif公司產(chǎn)品；蛋白質(zhì)定量測(cè)定試劑盒為Pierce公司產(chǎn)品；Western blot試劑盒為KPL公司產(chǎn)品；中分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)為Fermentas Life Science公司產(chǎn)品；β�瞐ctin為Amresco公司產(chǎn)品；抗NF��κB p65抗體（產(chǎn)品貨號(hào)：sc��8008, sc��372）及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記 山羊抗兔IgG均為Santa Cruz公司產(chǎn)品。圖像分析處理系統(tǒng)：ImageMaster VDS圖像分析儀、ImageMaster 2D Platinum 5.0軟件為Pharmacia公司產(chǎn)品。所有操作均按試劑盒說(shuō)明書提供的方法進(jìn)行。Tet注射液，30 mg/支（2 ml）為浙江康恩貝集團(tuán)金華制藥廠產(chǎn)品。

    1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 K562細(xì)胞用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，K562/A02細(xì)胞在含10％小牛血清、1 μmol/L ADM的RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，每天換液，2～3 d傳代一次。實(shí)驗(yàn)時(shí)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)液靜置6 h后，計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，活細(xì)胞數(shù)90％以上時(shí)進(jìn)行分組及干預(yù)，細(xì)胞密度按不同實(shí)驗(yàn)要求調(diào)整，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。K562細(xì)胞和K562/A02細(xì)胞分別分組，即分為K562細(xì)胞對(duì)照組、K562細(xì)胞Tet 6 h組、K562細(xì)胞Tet 12 h組和K562/A02細(xì)胞對(duì)照組、K562/A02細(xì)胞Tet 6 h組、K562/A02細(xì)胞Tet 12 h組。本實(shí)驗(yàn)所采用的各藥物劑量均系本課題組既往實(shí)驗(yàn)通過(guò)MTT法計(jì)算半數(shù)抑制濃度（50% inhibiting concentration, IC50）所得，其中1 μmol/L Tet為最佳有效逆轉(zhuǎn)濃度，該濃度無(wú)細(xì)胞毒作用，用于實(shí)驗(yàn)。

    1.4 NF��κB核轉(zhuǎn)位免疫細(xì)胞化學(xué)染色及結(jié)果判斷 操作按試劑盒說(shuō)明書提供的方法進(jìn)行，3�舶被���9�惨一�咔唑（3�瞐mino��9�瞖thylcarbazole, AEC）顯色，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，以細(xì)胞核有紅色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞，鏡下隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，計(jì)算胞核染色的陽(yáng)性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比。

    1.5 Western blot檢測(cè)NF��κB 操作按試劑盒說(shuō)明書提供的方法進(jìn)行，以BCIP/NBT顯色，待出現(xiàn)清晰的蛋白條帶時(shí)，終止顯色反應(yīng)。掃描濾膜并對(duì)電泳條帶進(jìn)行光密度分析。以65 ku處NF��κB蛋白條帶與β�瞐ctin條帶的比值作為各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)資料用x±s表示，用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD�瞭檢驗(yàn)。

    結(jié)果

    2.1 免疫細(xì)胞化學(xué)測(cè)定Tet對(duì)細(xì)胞NF��κB蛋白核轉(zhuǎn)位的影響

    2.1.1 Tet作用于K562細(xì)胞后免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果 鏡下可見，K562細(xì)胞對(duì)照組細(xì)胞的胞漿、胞核均無(wú)著色，其余各組K562細(xì)胞胞漿均可見紅色顆粒沉淀，活化的細(xì)胞NF��κB發(fā)生轉(zhuǎn)位進(jìn)入胞核，胞核也可見紅色顆粒沉淀。Tet作用于K562細(xì)胞6 h和12 h后，細(xì)胞胞核NF��κB陽(yáng)性率分別為（37.39±0.95）%和（40.81±0.79）%，與K562細(xì)胞對(duì)照組（39.64±0.92）%相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

    2.1.2 Tet作用于K562/A02細(xì)胞后免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果 K562/A02細(xì)胞對(duì)照組NF��κB陽(yáng)性細(xì)胞百分率為（65.03±4.18）%，與K562細(xì)胞對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與K562/A02細(xì)胞對(duì)照組比較，Tet作用于K562/A02細(xì)胞6 h和12 h后，NF��κB陽(yáng)性細(xì)胞百分率均明顯減少，分別為（52.65±1.12）%（P<0.05）和（45.89±2.04）%（P<0.01）。Tet作用于K562/A02細(xì)胞12 h的陽(yáng)性細(xì)胞百分率低于作用6 h組（P<0.05）。

    2.2 Western blot測(cè)定Tet對(duì)細(xì)胞NF��κB蛋白表達(dá)的影響

    2.2.1 Tet作用于K562細(xì)胞后胞核NF��κB蛋白表達(dá) Tet作用于K562細(xì)胞6 h和12 h后，NF��κB蛋白條帶與β�瞐ctin條帶的比值分別為2.260±0.073和2.299±0.021，與K562對(duì)照組（2.366±0.241）相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

    2.2.2 Tet作用于K562/A02細(xì)胞后6 h胞核NF��κB蛋白表達(dá) 各組NF��κB蛋白條帶與β�瞐ctin條帶的比值分別為：K562/A02細(xì)胞對(duì)照組3.545±0.219、K562細(xì)胞對(duì)照組2.366±0.241、K562/A02細(xì)胞Tet 6 h組2.528±0.196。K562/A02細(xì)胞胞核NF��κB蛋白表達(dá)水平明顯高于K562細(xì)胞（P<0.01）；Tet作用于K562/A02細(xì)胞6 h后，胞核NF��κB蛋白表達(dá)水平明顯低于K562/A02細(xì)胞對(duì)照組（P<0.05）。

    2.2.3 Tet作用于K562/A02細(xì)胞12 h胞核NF��κB蛋白表達(dá) 各組NF��κB蛋白條帶與β�瞐ctin條帶密度的比值分別為：K562/A02細(xì)胞對(duì)照組3.545±0.219、K562細(xì)胞對(duì)照組2.366±0.241、K562/A02細(xì)胞Tet 12 h組2.301±0.174。Tet作用于K562/A02細(xì)胞12 h后，胞核NF��κB蛋白表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組（P<0.01），與作用6 h相比，降低更明顯（P<0.05）。

    研究表明，抑制NF��κB活性可增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療的敏感性。發(fā)現(xiàn)高三尖杉酯堿0.5 μmol/L可明顯誘導(dǎo)K562細(xì)胞NF��κB活化，地塞米松1 μmol/L和長(zhǎng)春新堿0.1 μmol/L均能顯著抑制高三尖杉酯堿誘導(dǎo)的NF��κB活化，并增強(qiáng)其誘導(dǎo)K562�瞡細(xì)胞凋亡的作用。

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