漢防己甲素片對白血病耐藥細胞株K562/A02核因子κB表達的影響

導讀：白血病又稱“血癌”，是造血系統的惡性增殖性疾病，該病居年輕人惡性疾病中的首位，是嚴重威脅兒童健康的疾病之一。白血病是全身性腫瘤，以化療為主，根據白血病細胞不成熟的程度和白血病的自然病程，分為急性和慢性兩大類。研究表明，高輻射環境下、接觸化學原料、濫用藥物等是引發白血病的因素。因此，遠離誘因是防治的最佳手段。隨著分子生物學、生物遺傳學的進展，新療法、新藥物以及中藥的使用，使白血病預后得到極大的改觀。

    腫瘤耐藥是當今腫瘤治療的一大難題，一直是國內外研究的熱點。腫瘤耐藥的發生是多種機制共同作用的結果，其機制之一是調節細胞凋亡相關因子導致凋亡抵抗，如活化NF��κB、Bcl��2、突變型p53等。克服和干預腫瘤細胞耐藥是提高腫瘤療效的重要手段。中藥漢防己科植物粉防己具有行水和瀉下焦濕熱的功效，用于治療水腫臌脹、濕熱腳氣、手足痙攣等。漢防己甲素（tetrandrine, Tet）是從粉防己塊根中提取的生物堿，研究證實Tet是天然的非選擇性鈣通道阻滯劑，又是鈣調蛋白拮抗劑，臨床用于逆轉多藥耐藥（multiple drug resistance, MDR）時耐受性較好，無明顯副作用。核因子κB（nuclear factor�瞜appaB，NF��κB）是分布和作用十分廣泛的真核細胞轉錄調控因子，其與腫瘤發生發展、浸潤轉移以及腫瘤多藥耐藥有密切關系，可能成為提高腫瘤化療效果的治療新靶點。

    本課題組既往的實驗已證實，Tet能有效逆轉慢性粒細胞白血病急性紅白血病變細胞耐藥株K562/A02對化療藥物柔紅霉素的耐藥性；它逆轉耐藥可能與下調mdr1基因及P�蔡堑鞍祝≒glycoprotein, Pgp）的表達，改變細胞內鈣離子濃度［Ca2＋］i，下調bcr/abl基因等有關。為進一步了解該藥逆轉耐藥的作用機制，本實驗將檢測Tet對NFκB表達的影響，為該藥作為耐藥逆轉劑應用于臨床提供理論依據。

    材料與方法

    1.1 細胞株及來源 人慢性粒細胞白血病急性紅白血病變細胞株K562購自中國科學院上海細胞生物學研究所。人慢性粒細胞白血病急性紅白血病變阿霉素（adriamycin, ADM）耐藥細胞株K562/A02購自中國醫學科學院血液病研究所。

    1.2 主要儀器及試劑 免疫組化SP檢測試劑盒，為北京中山生物技術有限公司產品；蛋白提取試劑盒為Active Motif公司產品；蛋白質定量測定試劑盒為Pierce公司產品；Western blot試劑盒為KPL公司產品；中分子量標準蛋白質為Fermentas Life Science公司產品；β�瞐ctin為Amresco公司產品；抗NF��κB p65抗體（產品貨號：sc��8008, sc��372）及辣根過氧化物酶標記 山羊抗兔IgG均為Santa Cruz公司產品。圖像分析處理系統：ImageMaster VDS圖像分析儀、ImageMaster 2D Platinum 5.0軟件為Pharmacia公司產品。所有操作均按試劑盒說明書提供的方法進行。Tet注射液，30 mg/支（2 ml）為浙江康恩貝集團金華制藥廠產品。

    1.3 細胞培養及實驗分組 K562細胞用含10%小牛血清的RPMI 1640培養液培養，K562/A02細胞在含10％小牛血清、1 μmol/L ADM的RPMI 1640培養液中培養，置于37 ℃、5% CO2培養箱中，每天換液，2～3 d傳代一次。實驗時取對數生長期細胞，用無血清RPMI 1640培養液靜置6 h后，計數活細胞數，活細胞數90％以上時進行分組及干預，細胞密度按不同實驗要求調整，實驗重復3次。K562細胞和K562/A02細胞分別分組，即分為K562細胞對照組、K562細胞Tet 6 h組、K562細胞Tet 12 h組和K562/A02細胞對照組、K562/A02細胞Tet 6 h組、K562/A02細胞Tet 12 h組。本實驗所采用的各藥物劑量均系本課題組既往實驗通過MTT法計算半數抑制濃度（50% inhibiting concentration, IC50）所得，其中1 μmol/L Tet為最佳有效逆轉濃度，該濃度無細胞毒作用，用于實驗。

    1.4 NF��κB核轉位免疫細胞化學染色及結果判斷 操作按試劑盒說明書提供的方法進行，3�舶被���9�惨一�咔唑（3�瞐mino��9�瞖thylcarbazole, AEC）顯色，PBS代替一抗作為陰性對照，以細胞核有紅色顆粒者為陽性細胞，鏡下隨機選取5個高倍視野，計數500個細胞，計算胞核染色的陽性細胞占細胞總數的百分比。

    1.5 Western blot檢測NF��κB 操作按試劑盒說明書提供的方法進行，以BCIP/NBT顯色，待出現清晰的蛋白條帶時，終止顯色反應。掃描濾膜并對電泳條帶進行光密度分析。以65 ku處NF��κB蛋白條帶與β�瞐ctin條帶的比值作為各組實驗數據，每組實驗重復3次。

    1.6 統計學方法 數據資料用x±s表示，用SPSS 11.0統計軟件對數據進行統計分析，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD�瞭檢驗。

    結果

    2.1 免疫細胞化學測定Tet對細胞NF��κB蛋白核轉位的影響

    2.1.1 Tet作用于K562細胞后免疫細胞化學結果 鏡下可見，K562細胞對照組細胞的胞漿、胞核均無著色，其余各組K562細胞胞漿均可見紅色顆粒沉淀，活化的細胞NF��κB發生轉位進入胞核，胞核也可見紅色顆粒沉淀。Tet作用于K562細胞6 h和12 h后，細胞胞核NF��κB陽性率分別為（37.39±0.95）%和（40.81±0.79）%，與K562細胞對照組（39.64±0.92）%相比，差異無統計學意義（P>0.05）。

    2.1.2 Tet作用于K562/A02細胞后免疫細胞化學結果 K562/A02細胞對照組NF��κB陽性細胞百分率為（65.03±4.18）%，與K562細胞對照組相比，差異有統計學意義（P<0.01）。與K562/A02細胞對照組比較，Tet作用于K562/A02細胞6 h和12 h后，NF��κB陽性細胞百分率均明顯減少，分別為（52.65±1.12）%（P<0.05）和（45.89±2.04）%（P<0.01）。Tet作用于K562/A02細胞12 h的陽性細胞百分率低于作用6 h組（P<0.05）。

    2.2 Western blot測定Tet對細胞NF��κB蛋白表達的影響

    2.2.1 Tet作用于K562細胞后胞核NF��κB蛋白表達 Tet作用于K562細胞6 h和12 h后，NF��κB蛋白條帶與β�瞐ctin條帶的比值分別為2.260±0.073和2.299±0.021，與K562對照組（2.366±0.241）相比差異無統計學意義（P>0.05）。

    2.2.2 Tet作用于K562/A02細胞后6 h胞核NF��κB蛋白表達 各組NF��κB蛋白條帶與β�瞐ctin條帶的比值分別為：K562/A02細胞對照組3.545±0.219、K562細胞對照組2.366±0.241、K562/A02細胞Tet 6 h組2.528±0.196。K562/A02細胞胞核NF��κB蛋白表達水平明顯高于K562細胞（P<0.01）；Tet作用于K562/A02細胞6 h后，胞核NF��κB蛋白表達水平明顯低于K562/A02細胞對照組（P<0.05）。

    2.2.3 Tet作用于K562/A02細胞12 h胞核NF��κB蛋白表達 各組NF��κB蛋白條帶與β�瞐ctin條帶密度的比值分別為：K562/A02細胞對照組3.545±0.219、K562細胞對照組2.366±0.241、K562/A02細胞Tet 12 h組2.301±0.174。Tet作用于K562/A02細胞12 h后，胞核NF��κB蛋白表達水平明顯低于對照組（P<0.01），與作用6 h相比，降低更明顯（P<0.05）。

    研究表明，抑制NF��κB活性可增加腫瘤細胞對化療的敏感性。發現高三尖杉酯堿0.5 μmol/L可明顯誘導K562細胞NF��κB活化，地塞米松1 μmol/L和長春新堿0.1 μmol/L均能顯著抑制高三尖杉酯堿誘導的NF��κB活化，并增強其誘導K562�瞡細胞凋亡的作用。

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