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                老年性癡呆的基因治療與神經(jīng)生長因子

 

    【摘要】 

      基因治療正在成為常規(guī)方法難以治愈的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的新的治療手段。本文概要介紹了CNS基因治療的方法和途徑；CNS基因治療的病毒載體以及目前老年性癡呆基因治療研究與神經(jīng)生長因子作用機制的狀況。

 

    老年性癡呆(Alzheimer disease,AD)是德國著名神經(jīng)解剖學家和病理學家Alosis  Alzheimer于1907年首先描述,后人以其姓氏命名的。老年性癡呆是以進行性認知障礙和記憶能力損害為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退變性疾病。AD發(fā)病率因調(diào)查的對象、地區(qū)及標準不同而異,但有一個共同的趨勢,就是隨著人口年齡的增大而增多［1］。由于AD病程長,又缺乏有效的治療方法,眾多的AD病人給家庭和社會帶來嚴重的負擔。因此,尋找有效的AD治療方法已成為醫(yī)學界的緊迫課題。本文概要介紹了CNS基因治療的方法和途徑；CNS基因治療的病毒載體以及目前老年性癡呆基因治療研究與神經(jīng)生長因子作用機制的狀況。

 

　　1  基因治療

　　基因治療(genetherapy)是向功能缺陷或病變的細胞及組織引入互補的正�；�因或治療性功能基因,使其表達而達到治療疾病的方法。中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)作為一個高度獨立化器官,因其獨特的生理特征及細胞之間相互作用的復雜性,不易進行基因操作。近年來,由于神經(jīng)遺傳學研究的進展、CNS疾病發(fā)病機制的進一步闡明、導入外源性基因載體的改進及其基因轉(zhuǎn)移技術(shù)的進步,使基因介導CNS疾病的治療越來越趨近現(xiàn)實,CNS作為基因治療的靶器官正逐步實現(xiàn)［2］。

　　1.1  基因治療的方法和途徑

　　1.1.1  exvivo途徑  exvivo途徑即體外細胞介導法,通過移植攜帶靶基因的工程細胞完成,是基因轉(zhuǎn)移技術(shù)和腦內(nèi)移植技術(shù)的結(jié)合。首先將目的基因轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的靶細胞內(nèi),進行篩選、鑒定后,行體外擴增,然后將其移植入腦內(nèi)治療靶區(qū),使其在腦內(nèi)充當分泌營養(yǎng)因子、神經(jīng)遞質(zhì)和代謝酶等基因產(chǎn)物的生物學“微泵”(minipump),此細胞稱為基因修飾細胞或工程細胞。這種方法比較經(jīng)典、安全,效果較易控制,但是存在操作步驟多、技術(shù)復雜、難度大及若采用人類胚胎細胞則涉及倫理學問題,故不易推廣。

 

　　exvivo途徑中靶細胞的篩選是至關(guān)重要的,既要易于獲得、容易轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定表達,又要避免發(fā)生免疫反應(yīng)。應(yīng)遵循以下原則:(1)基因轉(zhuǎn)導的細胞必須能長期在宿主腦內(nèi)存活,且無侵襲性;(2)修飾后的靶細胞應(yīng)具有穩(wěn)定表達治療性產(chǎn)物的能力;(3)可體外控制治療性產(chǎn)物有效、適量的表達;(4)能預設(shè)某一安全機制,在必要時可激活以阻止修飾細胞在體內(nèi)有害的生長和(或)有害功能的發(fā)揮,以避免腫瘤發(fā)生。目前,應(yīng)用于CNS基因治療研究的靶細胞主要有成纖維細胞、原代骨骼肌細胞、膠質(zhì)細胞、胚胎中腦細胞、條件永生性神經(jīng)細胞(conditionally immortal izedneural  cell)及神經(jīng)干細胞。

 

　　1.1.2  invivo途徑  invivo途徑即體內(nèi)直接轉(zhuǎn)染法,是體內(nèi)基因治療的直接途徑。包括:(1)非病毒介導途徑即通過物理法、化學法或融合法直接將目的基因?qū)�入體內(nèi)。具有安全、操作簡單、插入容量不受限制及可通過物理方法實現(xiàn)靶向性轉(zhuǎn)移(如基因槍)等優(yōu)點。但是直接導入的DNA通常難以整合入基因組,基因表達存在不穩(wěn)定性,且在非分裂細胞中基因的轉(zhuǎn)染效率不高,使其應(yīng)用受到限制。(2)病毒載體介導途徑即通過構(gòu)建復制缺陷的重組病毒將靶基因引入體內(nèi)。迄今為止,病毒載體用于CNS細胞基因傳遞取得了許多進展,盡管其安全性及效率仍有待提高,但invivo方法已成為目前CNS基因轉(zhuǎn)移的主要研究方向,只有invivo方法取得成功,CNS基因治療才能走向臨床。

 

　　1.2  CNS基因治療的病毒載體

　　1.2.1  RNA病毒載體

　　1.2.1.1  逆轉(zhuǎn)錄病毒載體  逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是目前研究最成熟的一類RNA病毒載體。常用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體主要來自Moloney小鼠白血病病毒。它具有以下優(yōu)點：宿主范圍廣，能感染包括膠質(zhì)細胞、神經(jīng)前體細胞在內(nèi)的各種分裂細胞，感染效率高；在正常生理狀態(tài)下可以單拷貝的形式整合入宿主細胞基因組,并隨宿主細胞的分裂而增殖；病毒與細胞結(jié)合后，病毒表面的糖蛋白即結(jié)合于細胞表面的受體，故細胞不會被同種病毒重復感染。但仍存在一些令人擔憂的問題,如病毒基因組在宿主細胞染色體上的隨機整合可能引起插入突變；載體在輔助細胞中有可能發(fā)生同源重組，產(chǎn)生具有致瘤性的野生型病毒；此外逆轉(zhuǎn)錄病毒載體不能感染分裂后細胞，故不能直接用于神經(jīng)細胞的轉(zhuǎn)導。

　　1.2.1.2  慢病毒載體  慢病毒(lentivirus)屬逆轉(zhuǎn)錄病毒亞屬,是一類非鼠源性逆轉(zhuǎn)錄病毒,以人類免疫缺陷病毒(human immunod efficiency virus,HIV)為代表。慢病毒源性載體(lentivirus basedvector,LV)最主要的優(yōu)點是它能將外源基因整合入非分裂細胞的基因組內(nèi),對有絲分裂后神經(jīng)元轉(zhuǎn)基因治療提供了一個潛在的傳遞系統(tǒng)。但其嚴格的宿主范圍、滴度低及HIV 1獨特的致病性,限制了它作為轉(zhuǎn)基因載體的應(yīng)用。為了最大限度降低其通過重組產(chǎn)生有復制能力野生病毒的可能性,重組病毒的產(chǎn)生采用三質(zhì)粒包裝系統(tǒng),為了進一步增強這一系統(tǒng)的安全性,一種自我失活(selfinactivating,SIN)慢病毒載體最近已被構(gòu)建成功。應(yīng)用LV向腦內(nèi)引入基因已取得了誘人的結(jié)果,轉(zhuǎn)染細胞(主要為神經(jīng)元)在所有時間點上均明顯高于腺相關(guān)病毒載體和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,而且這種載體存在長期的轉(zhuǎn)基因表達,無明顯免疫反應(yīng)。因此LV有可能成為未來CNS基因治療的最佳載體［3.4］。

　　1.2.2  DNA病毒載體

　　1.2.2.1  單純皰疹病毒載體  Ｉ型單純皰疹病毒(herpes simplex virustypel ,HSV 1)含有152kb雙鏈DNA,基因組包含80個以上基因。HSV來源載體有重組子載體(HSV RV)和擴增子載體兩大類型。HSV RV含有全部病毒基因組,其中一個或多個基因已突變,以降低其毒性和提供轉(zhuǎn)基因空間。最新版本HSV RV刪除了多個含轉(zhuǎn)錄激活因子的即刻早期基因,基本消除了病毒基因的表達。HSV 擴增子載體由一個含有HSV DNA復制起點序列oris和包裝信號pac的質(zhì)粒組成。在HSV輔助病毒作用下被允許以串聯(lián)體形式包裝入HSV病毒,無HSV輔助病毒時,這些載體可以通過與一組已刪除HSV基因組保留pac信號序列的粘�；駼AC質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染而得到包裝。這些載體的優(yōu)點有:基本上無毒性或免疫原性;較大的轉(zhuǎn)基因容量,通�？蛇_22kb,最大可達150kb;相當高的滴度;對神經(jīng)細胞的高度感染性,在非分裂細胞中潛伏達數(shù)月。此外,HSV載體感染神經(jīng)元時,可沿著神經(jīng)元突起向其胞體快速逆向運輸,故可提供一種間接的靶向性基因轉(zhuǎn)移途徑。但HSV存在神經(jīng)細胞毒性作用和免疫反應(yīng),可引起較明顯的局部炎癥和壞死,故HSV作為CNS轉(zhuǎn)基因載體還有待于進一步研究和改進。         

　　1.2.2.2  腺病毒載體  腺病毒(adeno virus,Ad)是目前被較廣泛使用的一類DNA病毒載體,其基因組長約36kb,從左至右可分為4個基因功能區(qū)即E1 E4區(qū)。第一代復制缺陷型Ad因存在較強的宿主免疫反應(yīng),使其應(yīng)用受到限制。改進后的新型Ad載體刪除了表達病毒蛋白的E2ａ和E4基因或E4基因上特殊的開放性閱讀框,故具有長期的轉(zhuǎn)基因表達和較低的炎癥反應(yīng)。最近產(chǎn)生了一種“無內(nèi)核”(gutless)、高容量的Ad載體,刪除了病毒基因組所有的結(jié)構(gòu)基因,僅保留了復制和包裝的必需序列。這種“無內(nèi)核”Ad載體具有轉(zhuǎn)基因容量大、滴度高、宿主范圍廣,可感染分裂和非分裂細胞、感染效率高、無野生腺病毒污染等優(yōu)點,在體研究已顯示其長期的轉(zhuǎn)基因表達活性和較低的宿主炎癥反應(yīng)。其另一個特點是具有隨機整合人類或非人類染色體的能力,但整合效率較低,多數(shù)仍以附加子形式存在,而且已整合的載體序列容易發(fā)生重新組合。

　　1.2.2.3  腺相關(guān)病毒載體  腺相關(guān)病毒(Adeno associated virus,AAV)是一種缺陷型非病原性人類細小病毒,是目前發(fā)現(xiàn)的最小、結(jié)構(gòu)最簡單的DNA病毒,含有一條線狀單鏈DNA,其復制依賴于輔助病毒(腺病毒或單純皰疹病毒)。野生型AAV能選擇性整合入人類19號染色體的特定部位,建立溶源性感染。與其它基因載體系統(tǒng)相比較,AAV載體的主要優(yōu)點有:(1)它是一種非病原性的人類病毒,與人類疾病無關(guān)；(2)AAV能感染的細胞類型范圍較廣,可感染分裂后細胞,轉(zhuǎn)染效率極高;(3)載體中僅保存AAV的ITRs,而ITRs,基本上又是轉(zhuǎn)錄中性的,不干擾外源基因的表達和調(diào)控;(4)rAAV缺乏病毒基因,對超感染沒有免疫原性,故可以向同一細胞引入兩種不同的基因,或?qū)ν�一細胞反復感�?(5)轉(zhuǎn)基因可獲得長期穩(wěn)定的表達。新的包裝技術(shù)已明顯提高rAAV載體滴度,而且可排除輔助腺病毒的污染［5］。此外,可調(diào)控基因表達載體及針對不同細胞的靶向性載體的成功開發(fā),使其應(yīng)用前景更加廣泛。

1.2.3  雜交型病毒載體  由于目前的病毒載體系統(tǒng)不能自主復制,無法達到穩(wěn)定的CNS轉(zhuǎn)基因表達,而反復向腦內(nèi)注射載體會給患者帶來較高的危險。為了使CNS轉(zhuǎn)基因獲得長期、穩(wěn)定的表達,根據(jù)現(xiàn)有病毒載體的優(yōu)點,將其不同的病毒元件組合而產(chǎn)生的雜交型病毒載體,目前正在研究、開發(fā),主要包括HSV AAV雜交型擴增子載體、Ad EBV和HSV EBV 逆病毒雜交型擴增子載體、Ad AAV雜交型載體、Ad 逆病毒雜交型載體等幾種類型。不同載體系統(tǒng)優(yōu)缺點的客觀比較少見文獻報道,目前尚沒有一種載體可以作為所有疾病類型轉(zhuǎn)基因研究的通用工具,而且在以后的數(shù)年內(nèi)也不可能出現(xiàn)這種萬能的載體。在現(xiàn)階段Ad仍可能是以短期表達為治療目標invivo途徑基因研究最合適的載體,特別是那些單次劑量就能達到臨床治療效果的方案。如能實現(xiàn)Ad靶向性細胞攝取及表達,降低免疫原性,無疑將擴展其用途,但不適合慢性疾病的長期治療。在未來的幾年里,AAV可能是功能缺陷蛋白長期替代治療最常用的載體［6］。

 

　　2  老年性癡呆基因治療概況

　　2.1  老年性癡呆  AD患者腦內(nèi)主要的病理生理改變有兩大特征:第一是皮質(zhì)、海馬及皮質(zhì)下區(qū)等多個部位出現(xiàn)廣泛性的老年斑和神經(jīng)纖維纏結(jié);第二是神經(jīng)元變性和丟失及突觸數(shù)量的減少,其中基底前腦膽堿能神經(jīng)元變性和丟失最為明顯�；�底前腦膽堿能神經(jīng)元與AD患者的學習和記憶功能密切相關(guān),因此挽救基底前腦膽堿能神經(jīng)元的存活和減少其突觸的喪失是治療AD的關(guān)鍵。基底前腦膽堿能神經(jīng)元是神經(jīng)營養(yǎng)因子敏感細胞,其表面有神經(jīng)營養(yǎng)因子受體,給基底前腦膽堿能神經(jīng)元損害的大鼠腦內(nèi)提供外源性神經(jīng)營養(yǎng)因子,能夠保護膽堿能神經(jīng)元免受損害,可以促進損傷的神經(jīng)纖維再生長,并且大鼠的學習和記憶能力也有明顯的改善［7.8］。

 

　　2.2  老年性癡呆的基因治療  AD基因治療的早期策略是向腦內(nèi)移植遺傳修飾后的能產(chǎn)生NGF的自體同源細胞或神經(jīng)前體細胞［9］。除了神經(jīng)營養(yǎng)因子外,還可以通過神經(jīng)遞質(zhì)的恢復和替代方法治療AD,膽堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶(Cholineacetylase,ChA)是腦內(nèi)乙酰膽堿合成的限速酶,AD患者腦內(nèi)存在ChA活性下降,乙酰膽堿合成減少。轉(zhuǎn)導ChA基因,提高乙酰膽堿合成,可治療AD。最近,Saille等［10］研究發(fā)現(xiàn),表達人類抗凋亡基因bcl2的轉(zhuǎn)基因小鼠皮層神經(jīng)元,可明顯抵抗β 淀粉樣蛋白的神經(jīng)毒性損害,提示以抑制神經(jīng)元凋亡為目的的AD神經(jīng)保護基因治療具有研究潛力。

 

　　越來越多的證據(jù)說明β淀粉樣蛋白(特別是Aβ1-42)在腦內(nèi)沉積是AD早期的主要病理變化。APP、早老素1(PS1)和早老素2(PS2)的基因突變引起家族性AD,與Ab1-40和總β淀粉樣蛋白相比,Ab1-42相對增加。APP變異的轉(zhuǎn)基因鼠腦內(nèi)的纖維斑塊主要含Aβ1-42,并表現(xiàn)出AD的許多病理學特點。AD患者腦內(nèi)最初沉積的是Aβ1-42,而不是Aβ1-40。這些都支持淀粉樣蛋白沉積理論,因此抗淀粉樣蛋白治療是治療AD的一種方法。

 

　　2.2.1  Secretase Inhibitors分泌酶抑制劑  APP有α和β兩種裂解方式,Aβ內(nèi)的α分泌酶裂解APP生成非淀粉樣可溶性β APP和Ｃ端APP片段,另一方面,β分泌酶裂解APP的蛋白水解過程,隨后被γ分泌酶裂解,生成Ａｂ片段。γ分泌酶裂解的位置是決定Ａｂ1-42與Ａｂ1-40相對水平的關(guān)鍵因素,Ab1-42開始沉積,神經(jīng)毒性需要Ab的聚集。抑制β和(或)γ分泌酶能夠減少Aβ的產(chǎn)生。現(xiàn)已經(jīng)成功地克隆出一種β分泌酶BACG/Asp2,它可用來研究這些酶的特異性抑制劑。最近研究還發(fā)現(xiàn)presenilins實際上就是γ分泌酶,或是其中的一部分。讓帶有APP的AD轉(zhuǎn)基因鼠口服γ分泌酶抑制劑能降低鼠腦內(nèi)Aβ的水平,但用抑制γ分泌酶抑制劑會減少Notch信號的傳導,Notch信號傳導是各種細胞生長過程中的信號傳導方式［11］。

 

　　2.2.2  抑制tau蛋白的磷酸化  神經(jīng)纖維纏結(jié)中的雙股螺旋狀細絲的主要成分就是tau蛋白。Ａβ的纖維誘導tau蛋白磷酸化,使微管失去結(jié)合能力,導致樹突聚集(45)。Aβ還能增加tau蛋白激酶Ｉ、糖原合成酶3β(TPKI/GSK3b)等幾種蛋白激酶的活性,這些酶都能促進tau蛋白的磷酸化。這提示Ａβ纖維形成,通過激活GSK3b導致tau蛋白的非正常磷酸化,破壞微管的穩(wěn)定,可導致神經(jīng)元死亡。用GSK3b的反義核苷酸阻斷Aβ誘導的神經(jīng)細胞毒性作用有可能延緩AD的發(fā)展。最近合成的非ATP、競爭性、選擇性GSK3b抑制劑可避免tau蛋白的過磷酸化,這將是一種治療AD的新途徑［12］。

 

　　2.3  老年性癡呆的基因治療和神經(jīng)生長因子  AD基因治療的早期策略是向腦內(nèi)移植遺傳修飾后能夠產(chǎn)生NGF的神經(jīng)細胞系，但由于供體－宿主相容性的問題限制了現(xiàn)有神經(jīng)細胞的應(yīng)用。后來有人采用同時腦內(nèi)移植經(jīng)遺傳修飾后能夠產(chǎn)生NGF的3T3成纖維細胞和胚胎膽堿能神經(jīng)元，結(jié)果有效地促進了膽堿能神經(jīng)元的存活，并利用抗膽堿乙�；�轉(zhuǎn)移酶染色的方法發(fā)現(xiàn)膽堿能神經(jīng)末梢可向產(chǎn)生NGF的細胞方向出芽生長。在NGF的作用下，存活的膽堿能神經(jīng)元釋放乙酰膽堿的能力也有所加強。用原代培養(yǎng)的成纖維細胞做工程細胞也獲得了相似的治療效果，而且發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元軸突向富含NGF的移植物中生長的機制與星狀膠質(zhì)細胞往移植物中滲透有關(guān)。這些早期的研究留給人們的啟示是:可以利用腦內(nèi)移植經(jīng)遺傳修飾后能夠產(chǎn)生神經(jīng)營養(yǎng)因子的工程細胞的方法達到治療神經(jīng)系統(tǒng)變性性疾病及神經(jīng)修復的目的。除了神經(jīng)營養(yǎng)因子外，還可以通過神經(jīng)遞質(zhì)的恢復或替代方法治療AD。通過向病變區(qū)導入乙酰膽堿以補充局部神經(jīng)遞質(zhì)的不足有可能促進功能的恢復和改善。另一種方法更為簡易和使用的方法是通過構(gòu)建適當?shù)闹亟M基因和表達載體來制備能夠穿過血腦屏障的融合蛋白，從而達到從外周非神經(jīng)組織移植細胞經(jīng)血液循環(huán)向CNS提供具有特殊治療作用的大分子多肽的目的。Friden等報道將NGF和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的抗體相結(jié)合，這一復合物不僅可以穿過血腦屏障，而且可以促進移植的膽堿能神經(jīng)元的存活。  給患者腦內(nèi)提供外源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的途徑很多,但基因治療AD一直是近幾年來研究的重要策略［13］。

 

　　基因治療AD一直是多年來研究的重點課題，但是目前還存在許多的問題，基因合成的神經(jīng)營養(yǎng)因子價格昂貴，有待于降低成本提高產(chǎn)量以滿足臨床的需求；轉(zhuǎn)基因治療給AD患者帶來了曙光，在神經(jīng)營養(yǎng)轉(zhuǎn)基因治療AD的研究中，對于BDNF和GDNF的研究尚處于起步階段；而AD患者腦內(nèi)神經(jīng)元潰變相當廣泛，目前轉(zhuǎn)基因治療AD的研究主要是針對一個或幾個腦區(qū)，因此還需要進一步的改進和探索；另外，目的基因表達產(chǎn)物在腦內(nèi)的表達的量和活性的改變以及基因治療的方法還不夠成熟等等還需進一步的研究和探索［13］。

 

　　可以預見，隨著人類基因組計劃的完成。AD的發(fā)病機制的進一步闡明，有效治療的靶基因的發(fā)現(xiàn)導入外源性基因載體的改進及其基因轉(zhuǎn)移技術(shù)的改進，基因表達產(chǎn)物在腦內(nèi)的表達的量和活性的控制技術(shù)不斷成熟，基因治療必將成為治療AD的新的強有力的手段［14］。

 

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