靈芝多糖誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG2凋亡

徐晉，吳麗，徐巧芳

(江蘇省第二中醫(yī)院外科，江蘇南京 210017)

 

    肝必復(fù)軟膠囊的主要成分取自樹(shù)舌靈芝多糖，能有效促使乙肝表面抗原轉(zhuǎn)陰，為乙肝患者帶來(lái)康復(fù)福音。本文就藥理學(xué)角度，初步研究探討靈芝多糖誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG2凋亡的作用。

    20世紀(jì)70年代以來(lái)，國(guó)內(nèi)外一系列研究證明傳統(tǒng)中藥?kù)`芝(Ganoderma lucidum)具有免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、保肝、抗氧化等藥理作用，尤其是其抗腫瘤活性日益受到關(guān)注。靈芝多糖(GLPS)是靈芝水提物中的主要活性成分，對(duì)動(dòng)物移植性腫瘤具有抑制作用，可使瘤重減輕，生存時(shí)間延長(zhǎng)。但其作用機(jī)制目前還處于研究階段，因此本研究主要通過(guò)觀察靈芝多糖與常規(guī)化療藥物 (氟尿嘧啶) 聯(lián)合使用對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的體外生長(zhǎng)狀況，檢測(cè) Caspase-3、Caspase-8酶活性有無(wú)顯著變化，并采用Western-blotting技術(shù)檢測(cè)作用后肝癌細(xì)胞HepG2的細(xì)胞色素C、Caspase-3、Caspase-8蛋白的表達(dá)水平，對(duì)其抗腫瘤機(jī)制做進(jìn)一步的研究，為靈芝多糖的藥用價(jià)值提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 資料與方法
    1.1 實(shí)驗(yàn)資料
    段木栽培靈芝多糖 (Ganodenna lucidum Polysaccharides，GLPS)由福州綠谷生物藥業(yè)技術(shù)研究所提供。褐色粉末，易溶于水，平均分子量為584900。多糖與肽的比值為93.45％：6.49％，多糖部分由鼠李糖、木糖、果糖、半乳糖、甘露糖和葡萄糖組成；MTT[溴化 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑](美國(guó)sigma公司產(chǎn)品)、二甲基亞砜(DMSO，上海凌峰公司,分析純)、RPMI 1640培養(yǎng)液(DMEM)和胎牛血清(美國(guó)GIBCO公司)、氟尿嘧啶注射液(南通精華制藥有限公司，批號(hào)080212)、兔抗人細(xì)胞色素C、Caspase-3、Caspase-8、一抗IgG(美國(guó)Santa Cruze公司) 、B-actin單抗、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗IgG(武漢博士德生物有限公司)，其余試劑均為分析純級(jí)。

    1.2 細(xì)胞處理
    肝癌HepG2細(xì)胞，購(gòu)丁上海亞培生物科技有限公司，細(xì)胞用5％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，37℃，5％C02，傳代培養(yǎng)。每24～48小時(shí)傳代1次。控制細(xì)胞密度為 2×105／ml，加藥時(shí)稀釋培養(yǎng)液，加入無(wú)血清R PMI 1640配制成的各組含藥培養(yǎng)液200μL，37℃，5％CO共孵育48h后，監(jiān)測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。

    1.3 分組方法
    分為A、B、C、D、E 5組，其中，A組：對(duì)照組；B組：氟尿嘧啶50μg/ml；C組：氟尿嘧啶50μg/ml+GLPS 1μg/ml；D組：氟尿嘧啶50μg/ml+GLPS 10 μg/ml；E組：氟尿嘧啶50μg/ml+GLPS μg/ml。

    1.4 MTT法測(cè)細(xì)胞增殖抑制率
    MTT粉劑以超純水配制成5 mg/ml工作液，細(xì)胞作用48h后，每孔加入20μL MTT，37℃孵育4h，吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液后，加入DMSO 100 μL終止反應(yīng)，繼續(xù)孵育30min，待結(jié)晶完全溶解后，490nm波長(zhǎng)下用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定各孔OD值。細(xì)胞增殖抑制率計(jì)算公式：抑制率(％)=(實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組0D值)×100％。
 
    1.5 流式Annexin V／PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡
    細(xì)胞作用后，以1：4稀釋Binding buffer(50ml Buffer+150 ml蒸餾水)重懸細(xì)胞，并坷整細(xì)胞濃度lx106 ／m1．取95μl細(xì)胞懸液加入1μL Annexin V-FITC，室溫孵育30min加入2μLPI，室溫孵育10min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

    1.6 Caspase活性檢測(cè)
    Caspase-3、Caspase-8活性測(cè)定是依據(jù)色敏底物DEVD-pNA(對(duì)硝基苯胺)被活化的Caspase-3剪切后產(chǎn)生的 pNA單體，在400 nm波長(zhǎng)的光密度(A)值而測(cè)定。細(xì)胞作用48h后，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，測(cè)定A值。以 A400值表示Caspase-3、Caspase-8活性大小。

    1.7 Western-Blotting方法檢測(cè)HepG2細(xì)胞的Caspase-3、Caspase-8蛋白的表達(dá)水平
    將細(xì)胞培養(yǎng)于10 cm的培養(yǎng)皿中，藥物作用 48h后，用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下，加入100L細(xì)胞裂解液冰上裂解30min。所得裂解液于4℃下12000 r／min離心機(jī)離心10min。取清液加入1／4體積的5xSDS蛋白加樣緩沖液．煮沸10 min。所得蛋白樣品經(jīng)12％SDS-PAGE分離后，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，以5％的脫脂奶粉37℃封閉2h后，依次加入一抗(室溫2h，PBS／T洗2次)、羊抗兔二抗(室溫2h，PBS／T洗2次)，ECL暗室中顯色。運(yùn)用Bioimagining System成像分析系統(tǒng)觀察Westem-B1otting結(jié)果，對(duì)反應(yīng)條帶灰度掃描并進(jìn)行半定量分析。

    1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
    采用 SPSS11.0軟件處理系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x+s表示。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用F檢驗(yàn)、Pearson相關(guān)分析，組內(nèi)比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，組間計(jì)量資料均數(shù)比較用方差分析，P<0.05．差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果
    2.1 GLPS對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2增殖的影響
    GLPS對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2增殖的影響見(jiàn)表1 。MTT結(jié)果顯示：?jiǎn)为?dú)使用氟尿嘧啶對(duì)HepG2細(xì)胞的增值抑制較低，GLPS 1μg/ml、10 μg/ml、100μg/ml 3個(gè)劑量與氟尿嘧啶 50μg/ml聯(lián)合使用對(duì)HepG2細(xì)胞增殖較單獨(dú)使用氟尿嘧啶的B組細(xì)胞均有顯著抑制作用(P<0.05)，抑制作用隨藥物濃度增高而有加強(qiáng)趨勢(shì)，最高抑制率可達(dá)34.8％，且3個(gè)劑量組間比較，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

 

 

 

    2.2 GLPS作用后肝癌細(xì)胞HepG2的細(xì)胞凋亡
    流式細(xì)胞儀 Annexin V／PI法檢測(cè)肝癌細(xì)胞HepG2在藥物作用48h后的凋亡百分率。結(jié)果顯示單獨(dú)使用氟尿嘧啶的B組細(xì)胞未發(fā)生明顯的凋亡(P>0.05)，而聯(lián)合使用GLPS的處理組細(xì)胞，凋亡的細(xì)胞明顯增加，見(jiàn)圖1，且隨著GLPS使用濃度的增大，凋亡細(xì)胞的比例也有所上升(P<0.05)。

    2.3 HepG2細(xì)胞的Caspase活性
    細(xì)胞作用48h后測(cè)定對(duì)照組及各處理組Caspase-3、Caspase-8酶活件的A400值，圖2。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，單獨(dú)使用氟尿嘧啶的B組細(xì)胞Caspase酶活性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而聯(lián)合使用GLPS的處理組細(xì)胞Caspase-3、Caspase-8 酶活性顯著升高(P<0.05)，且GLPS低濃度使用時(shí)Caspase-8酶活性顯著升高，隨著GLPS使用濃度的增加，Caspase-3酶活性逐漸增強(qiáng)。

 

 

 

    2.4 HepG2細(xì)胞的Caspase-3、Caspase-8、線粒體細(xì)胞色素C蛋白的表達(dá)
    與對(duì)照組比較，單獨(dú)使用氟尿嘧啶的B組細(xì)胞Caspase-3、Caspase-8、線粒體細(xì)胞色素C蛋白的表達(dá)，P>0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，如圖3；而聯(lián)合使用GLPS處理的各組細(xì)胞的蛋白則有顯著變化，GLPS低濃度使用時(shí)線粒體細(xì)胞色素C、Caspase-8蛋白表達(dá)顯著升高。隨著GLPS使用濃度的增加，Caspase-3蛋白表達(dá)也逐漸增強(qiáng)，與β-actin相比的相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)圖4。 

 

 

 

    3 討論
    靈芝多糖是從靈芝中提取的一種新內(nèi)源活性物質(zhì)，其所含的化學(xué)成分能夠顯著提高吞噬細(xì)胞的吞噬能力，增強(qiáng)體液免疫和細(xì)胞免疫功能，還能提高紅細(xì)胞中超氧化物歧化酶SOD活性，對(duì)人體具有顯著的抗腫瘤、抗癌作用。靈芝多糖抗腫瘤活性能是通過(guò)其對(duì)免疫活動(dòng)或?qū)λ拗鞴δ艿挠绊懚�介�?dǎo)的，且水溶性多糖能起著更重要的作用。HepG2細(xì)胞具有典型肝癌細(xì)胞的一系列惡性特征，是研究和評(píng)價(jià)防治肝癌藥物的較理想的細(xì)胞模型。

    本實(shí)驗(yàn)采用MTT法測(cè)定細(xì)胞活性，并計(jì)算細(xì)胞增值抑制率。研究結(jié)果表明，GLPS 1、10、100μg/ml 3個(gè)有效藥物濃度與常規(guī)化療藥物氟尿嘧啶50 μg/ml聯(lián)合使用對(duì)HepG2細(xì)胞增殖有顯著抑制作用，其最大抑制率可達(dá)34.8％，提示GLPS能在一定程度上抑制人肝癌細(xì)胞的增殖以延緩肝癌的進(jìn)程。

    細(xì)胞凋亡是不同于細(xì)胞壞死的一種特殊的細(xì)胞死亡形式。細(xì)胞凋亡信號(hào)能引起線粒體細(xì)胞色素C釋放，作為凋亡誘導(dǎo)因子，細(xì)胞色素C能與Apaf-1、Caspase-9前體、ATP／dATP 形成凋亡小體 (apoptosome)，進(jìn)而引發(fā)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)。

    凋亡程序的啟動(dòng)及執(zhí)行過(guò)程中，Caspase-3是Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)中最關(guān)鍵的效應(yīng)蛋白酶，通常以酶原的形式存在，激活后通過(guò)酶解其特異性底物，使細(xì)胞發(fā)生凋亡。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，GLPS與氟尿嘧啶聯(lián)合作用48h后，肝癌HepG2細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-8酶活性明顯升高，Western-Blotting實(shí)驗(yàn)證實(shí)，低濃度GLPS與氟尿嘧啶聯(lián)合作用組，Caspase-8、細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)顯著升高，而隨著GLPS濃度升高，Caspase-3蛋白表達(dá)量亦逐漸升高，而單獨(dú)使用氟尿嘧啶時(shí)與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此筆者認(rèn)為GLPS與氟尿嘧啶聯(lián)合作用可能會(huì)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞釋放細(xì)胞色素C，引起Caspase的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而進(jìn)步導(dǎo)致HepG2細(xì)胞的凋亡。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Annexin V／PI流式細(xì)胞儀檢測(cè)，證實(shí)GLPS與氟尿嘧啶聯(lián)合作用后，HepG2細(xì)胞發(fā)生了顯著的凋亡。

    由此，我們推斷靈芝多糖可能與化療藥物存在一定的協(xié)同作用，聯(lián)合使用有較好的抗腫瘤效應(yīng)，可能成為有效的腫瘤化療輔助藥物，有重要的研究意義，具有一定的運(yùn)用前景。

 

(收稿日期：2009-10-13)