消癌平抗肝癌細(xì)胞的實驗研究

    消癌平(XAP)注射液是由通關(guān)藤根部提取的滅菌水溶液，為國內(nèi)新一代純中藥抗癌藥物，高效低毒，它具有獨特的藥理作用機(jī)制，既能夠增強(qiáng)機(jī)體的免疫能力。又能夠殺滅多種腫瘤細(xì)胞，具有顯著的抑制腫瘤之功效，并能明顯延長癌癥患者的生存期。同時還具有消炎、平喘、利尿等治療作用。為此我們通過體外培養(yǎng)肝癌細(xì)胞Hepal一6，研究了消癌平對肝癌的生長抑制作用，并對其抑制生長的機(jī)制進(jìn)行了探討研究。 

    主要試劑與儀器：達(dá)氏修正依氏培養(yǎng)基(DMEM)為Inritrogen公司產(chǎn)品，小牛血清、胰蛋白酶(Trypsin)及噻唑藍(lán)(MrITI’)均購自武漢博士德生物工程有限公司。青霉素、鏈霉素為HyClone公司產(chǎn)品。二甲基亞砜(DMSO)：天津市化學(xué)試劑公司。鼠抗人Bcl一2、Bax、B—actin單克隆抗體以及辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠多克隆抗體均購于Santa Cruz公司。ZS一2板式酶標(biāo)儀(中國航天工業(yè)總公司)，SW—CJ—FD型超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，CO：細(xì)胞培養(yǎng)箱，光學(xué)顯微鏡。 

    細(xì)胞培養(yǎng)：小鼠Hepal一6肝癌細(xì)胞株由中國農(nóng)科院細(xì)胞庫提供，培養(yǎng)于含t0％胎牛血清、80 u，ml青霉素、100 U／ml鏈霉素的達(dá)氏修正依氏培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng)液中，置37℃、5％CO：、飽和濕度條件下培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，然后將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中貼壁生長，每3-4 d傳代1次。 

    MTY法檢測細(xì)胞增殖：取對數(shù)生長期Hepal一6肝癌細(xì)胞，用0．25％胰酶消化，以2x105／ml按每孔0．2 ml將對照組和不同濃度給藥組細(xì)胞接種于96孑L培養(yǎng)板中，每個濃度設(shè)6個平行孔，同時設(shè)不加藥的對照組和不含細(xì)胞的空白組．分別培養(yǎng)1、3、5 d后每孔加入MTF工作液(5 mg／m1)20 Ixl，繼續(xù)孵育4 h，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入150 l DMSO，振蕩使結(jié)晶溶解后，在酶標(biāo)儀490 nm波長處檢測各孔吸光度值(A，490
rim)。 

    細(xì)胞形態(tài)的觀察及傳代試驗：將Hepal一6肝癌細(xì)胞接種于放有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后，加人不同濃度的消癌平，對照孔只加培養(yǎng)液，置于孵箱內(nèi)3 d后取出覆蓋有細(xì)胞的蓋玻片，常規(guī)蘇木素一伊紅(HE)染色后觀察。 

    結(jié) 果：消癌平對Hepal一6細(xì)胞增殖的影響：Hepal一6細(xì)胞在消癌平不同濃度、不同時間作用后，MTT比色法結(jié)果表明，消癌平抑制Hepal一6細(xì)胞的增殖，且對其生長抑制作用隨消癌平作用時間的延長和劑量的增大而增加，呈時間和劑量依賴性。各給藥組與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0．01)，組問比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0．O1)。 

    傳代試驗表明，對照組細(xì)胞正常貼壁生長、傳代，分裂增殖旺盛，而給藥的Hepal一6細(xì)胞則失去傳代能力，出現(xiàn)懸浮現(xiàn)象。消癌平藥物濃度越高，上述表現(xiàn)越明顯，存在劑量依賴性。消癌平對Hepal一6細(xì)胞凋亡的影響：Hepal一6肝癌細(xì)胞經(jīng)不同劑量組消癌平作用3 d后，均在GgG 期前出現(xiàn)一個亞二倍體峰，經(jīng)凋亡程序軟件去除細(xì)胞碎屑后分析，確認(rèn)為凋亡峰，且該峰隨著消癌平作用濃度的增高而升高。經(jīng)10、20、30 mg／ml消癌平作用3 d后，凋亡細(xì)胞分別占(20．4+0．9)％、(34-4±0．9)％和(37．5±0．9)％。 

    本研究將其作用于小鼠Hepal一6肝癌細(xì)胞，通過MrIT試驗發(fā)現(xiàn)，消癌平能夠有效抑制Hepal一6細(xì)胞增殖，且呈明顯的時間依賴性和濃度依賴性。腫瘤細(xì)胞常表現(xiàn)為分化不良或未分化，應(yīng)用抗癌藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化，使其形態(tài)和功能趨向正�；蚪咏�正常，失去無限制生長繁殖的特征，從而達(dá)到抑制腫瘤的生長。為此我們通過細(xì)胞爬片HE染色，從形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)加以驗證，發(fā)現(xiàn)給藥后Hepal一6肝癌細(xì)胞偽足回縮，細(xì)胞變小、變圓，核分裂像減少，凋亡細(xì)胞散在分布，細(xì)胞出現(xiàn)懸浮現(xiàn)象，失去傳代能力，腫瘤的發(fā)生發(fā)展不僅僅是腫瘤細(xì)胞無限增殖的結(jié)果，同時也與腫瘤細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)，二者在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的地位同等重要。細(xì)胞凋亡是由基因調(diào)控的細(xì)胞程序性死亡，其中存在Fas／Fas—L介導(dǎo)的死亡受體通路 和Bcl一2家族調(diào)節(jié)的線粒體通路 。 

    (本文節(jié)選自《消癌平抗肝癌細(xì)胞體外生長的實驗研究》)

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